14.3. Определение механизма ингибирования из вида кинетической кривой роста популяции микроорганизмов

Как правило, кинетические исследования в микробиологии заключаются в изучении кривых роста микробной популяции. При этом важно из такого рода данных получить максималь­ную информацию. Проведенный анализ дает возможность из вида измененной кривой роста ответить на вопрос: имеет ли место в данном конкретном случае неосложненный рост или развитие культуры сопряжено с эффектами ингибирования продуктом или субстратом?

Сравнение кинетических уравнений для процессов без инги­бирования с уравнением для конкурентного ингибирования, неконкурентного и ингибирования избытком субстрата показы­вает, что в рамках приближенного рассмотрения при глубинах процесса, не превышающих 0,5 - 0,6, кинетика роста популяции может быть описана формально одним и тем же уравнением

(14.20)

(14.21)

где Ф, φ — параметры, отражающие механизм процесса.

Различие параметров Ф и φ заключается в использовании нормировочного множителя, приводящего переменную N—N₀ к безразмерному виду. Если экспериментальные данные получе­ны в условиях, при которых наиболее точно определяется максимальная плотность культуры N_m или Y_S и S₀, то наиболее правильно использовать безразмерную переменную (N — N₀)/N_т. Это приводит к уравнению (14.20) и соответ­ственно к параметру Ф. Если достаточно точно найдено значение N₀, то удобно нормировать данные N — N₀ на значение N₀, что приведет к параметру φ.

Неосложненный рост, ингибирование продуктом и субстратом могут быть дифференцированы, если экспериментально найти значение Ф или φ. Действительно, в условиях глубокого эффективного ингибирования продуктом параметр Ф существен­но больше единицы, для ингибирования субстратом Ф<0 (отрицательное число), в то время как для неосложненного роста характерно 1>Ф>0. Уже на основании определения Ф можно провести идентификацию условий роста популяции.

Для определения параметра Ф (или φ) необходимо восполь­зоваться одной из линейных анаморфоз уравнения (14.20). Важно еще раз подчеркнуть, что значение Ф (или φ) определяется из экс­периментальных данных для всех условий развития процесса по одному и тому же уравнению, например, из зависимости от:

(14.22)

Для определения μ и Ф можно также воспользоваться разностным методом, поскольку N_i и N_j определенные при двух фиксированных временах τ_i и τ_j связаны между собой уравнением

(14.23)

В этих уравнениях параметр Ф определяется как тангенс угла наклона зависимости от (рис. 14.1). Видно, что при сильном проявлении осложняющих эффектов механизм роста культуры может быть идентифицирован довольно строго.

Теоретически можно дискриминировать механизм ингибирования (отличить конкурентное ингибирование от неконкурентного) и найти числовые значения параметров, в первую очередь константы ингибирования К_i. При этом нужно иметь в виду, что с усложнением анализа возрастают требования к точности экспериментального изучения кривых роста культуры. По-видимому, точность измерений в обычном микробиологическом эксперименте в большинстве случаев недостаточна для углубленного анализа. Тем не менее, интересно рассмотреть принципиальные возможности метода.

Рис.14.1. Кривые роста, построенные в координатах уравнения (14.23) для случаев:1 – ингибирование продуктом (Ф>1); 2 – неосложненный рост (0<Ф<1); 3 – ингибирование субстратом (Ф<0)

Для того чтобы достоверно выявить ингибирование продук­том, идентифицировать механизм ингибирования, необходимо снять кривые роста культуры при нескольких исходных кон­центрациях субстрата в широком диапазоне его концентраций.

Для идентификации механизма и определения константы ингибирования продуктом предлагается следующая процедура.

Исследование зависимости кинетической кривой роста от концентрации субстрата дает два параметра: μ и Ф. Значения μ_т и К_S находят из обычной линеаризации уравнения для удельной скорости роста. Далее, для каждой концентрации S₀ при найденном значении К_S может быть вычислена функция . Можно записать соотношения для неосложненного роста и роста при конкурентном и неконкурентном ингибировании:

(неосложненный рост); (14.24)

(конкурентное ингибирование); (14.25)

(неконкурентное ингибирование) (14.26)

Видно, что механизмы роста могут быть дискриминированы на основании зависимости экспериментально найденных параметров, представленных в левой части уравнений (14.24) — (14.26) от концентрации субстрата. Как следует из уравнения (14.24), в том случае, если при развитии культуры отсутствуют процессы ингибирования избытком продукта, зависимость от концентрации субстрата должна быть представлена прямой линией с нулевым тангенсом угла наклона. Если развитие культуры сопровождается конкурентным ингибированием продуктом, то кривая зависимостиотS ₀ должна иметь линейный характер, тангенс угла наклона которой позволяет определить константы . Для микробного процесса с неконкурентным ингибированием продуктом зависимость имеет не линейный, а квадратичный характер. Экспериментальные данные для механизма неконкурентного ингибирования продуктом должны линеаризоваться в координатах зависимости от. Тангенс угла наклона кривой этой зависимости равен .

Таким образом, кинетический анализ позволяет интерпретировать достаточно сложные кривые роста популяции микроорганизмов в условиях ингибирования продуктом и субстратом и определить основные количественные характеристики процесса.

Идентификация механизма дает в руки исследователя или практика мощный инструмент управления ростом популяции. Если развитие процесса протекает в условиях неосложненного роста, интенсифицировать рост клеток до определенного предела можно путем увеличения концентрации субстрата. Если параметр Ф отрицателен и процесс протекает с ингибированием субстратом, этот эффект можно предотвратить уменьшением концентрации субстрата, при этом скорость роста популяции возрастет. Если обнаружено, что Ф существенно превышает единицу, то ингибированию продуктом можно воспрепятствовать, уводя его из зоны ферментационного процесса.