Приготовление и обработка. Мазков крови

Для микроскопического исследования крови пользуются препаратами, при­готовленными на обыкновенных предметных стёклах. Однако, при этом отдают предпочтение ещё не бывшим в употреблении стёклам с ровной, гладкой поверхностью, без царапин, выпуклостей, шероховатостей. Все эти недо­статки неминуемо отражаются на мазке (неравномерность распределения фор­менных элементов, оседание краски и т. д.). В случае нужды пользуются иногда и старыми стёклами после тщательной очистки и мытья их, бракуя и выбрасывая все непригодные.

Для приготовления хорошего мазка требуются тщательно приготовленные стёкла, хорошо обезжиренные, очищенные от следов кислот и щелочей. Новые, ещё не бывшие в употреблении стёкла, очищают от пыли и механических ча­стиц в холодной воде, затем протирают щёткой в тёплой воде и после этого промывают в течение 2—3 часов довольно сильной струёй воды. После промы­вания стекла перетирают сухой и мягкой полотняной тряпочкой и сохраняют в широкогорлых склянках в смеси спирта с эфиром (ana partes). Стёкла, быв­шие в употреблении, после удаления (кусочком смоченной в бензине ваты) кедрового масла, очищают в тёплой мыльной воде и после нагревания при тем­пературе 50—70° на водяной бане выдерживают в течение нескольких дней в хромовой смеси, после этого их прополаскивают в проточной воде. Перед употреблением стёкла извлекают из сосуда при помощи пинцета и тщательно, не касаясь рукой поверхности, вытирают чистой тряпочкой.

Большое значение имеет затем подготовка операционного поля; небрежно­сти в этом отношении также отражаются на свойствах мазка. Она состоит в том, что на довольно большой поверхности кожи выстригают гладко шерсть, так, чтобы стекло при взятии крови не приходило в соприкосновение с отдельными волосками. Кожу недолго массируют, протирают основательно спиртом для удаления кожного сала и затем осторожно очищают поверхность эфиром. Наи­более удобным местом операции у всех животных считают обыкновенно наружную или внутреннюю поверхность уха. При местном спазме сосудов, довольно час­том при лихорадке, кровь добывают путём укола кожи верхней или нижней губы.

Для получения капли крови пользуются обыкновенно колющими инстру­ментами— оспенной иглой, иглой Дженнера, иногда флицем, концом скаль­пеля; для мелких животных очень удобна игла Франка. Конечно, инструменты должны содержаться в надлежащей чистоте. Иглы Франка очищаются обыкновенно спиртом или эфиром, остальные инструменты после механической очистки лучше простерилизовать.

Первую каплю крови, выступившую пос­ле прокола кожи, стирают тщательно ват­кой. Вторую используют для изготовления мазка, исследования на гемоглобин, подсчёта эритроцитов и т. д. Кровь нужно исполь­зовать, по возможности, быстрее, пока она ещё не потеряла своих физических свойств. Быстро наступающее свёртывание крови де­лает приготовление хорошего мазка совер­шенно невозможным.

Самый процесс приготовления мазка, т. е. взятие крови и её размазывание по поверх­ности стекла, заслуживает также большого внимания. Различные промахи и отступле­ния от принятой методики сильно отража­ются на качестве препарата, делая его часто совершенно непригодным для исследования. Неудивительно поэтому, что первые попытки учащегося приготовить хороший мазок обыч­но кончаются неудачей.

В момент нанесения материала предметное стекло удерживают в правой руке, зажав его рёбра между большим и указательным пальцами, и осторожно приво­дят в соприкосновение с каплей крови. Как только капля «села на поверх­ность», сейчас же берут стекло в левую руку и удерживают за короткие рёбра

Рис. 130- Приготовление мазха крови.

между большим и указательным пальца­ми (рис. 130). Правой рукой захватывают затем покровное или узкое шлифованное стекло, ставят его на предметное, ближе к капле крови, под углом в 45° и осторожно приводят в соприкосновение с кровью, ко­торая быстро распределяется полосой в образовавшемся углу. Осторожно, ста­раясь не травматизировать клетки приго­товляемого мазка, с некоторым, однако, нажимом и достаточно быстро, двигают его к противоположному концу. Следуя за движением руки, кровь покрывает по­верхность предметного стекла равномер­ным и тонким слоем.

С целью выбраковки негодных препаратов обращают внимание на длину, ширину, густоту мазка и равномерность распределения крови по стеклу. Хороший мазок должен быть достаточно длинным, тонким, по возможности, равномерным, без просветов, пустот. Кроме того, мазок должен быть уже предметного стекла, иметь ровные, вытянутые по прямой линии края и конец, постепенно, без резких зазубрин, сходящий на-нет.

Зимой и осенью только что приготовленные препараты следует защищать от действия паров воды, так как конденсирующиеся на холодной поверхности стекла пары быстро их гемолизируют. Летом мазки повреждаются мухами,которые жадно набрасываются и быстро пожирают свежеразмазанную кровь. Успевшие уже высохнуть препараты нумеруют с обозначением даты и за­вёртывают в длинную полосу бумаги или сохраняют в особых шкафах, ящиках или папках. Номер и дату наносят обыкновенным пером или булавкой посре­дине мазка. Другие способы — наклейка, записи пишущими на стекле каран­дашами и чернилами, записи на бумаге — менее удобны.

При дальнейшей обработке и хранении удачно приготовленных мазков следует тщательно оберегать их от насекомых, действия влаги, обычных для лабораторий паров кислот и щелочей, дыма, различных газов. Все зти недо­чёты хранения мазка сильно отражаются на окраске, делая порой негодными хорошо приготовленные препараты.

Целый ряд чисто физиологических факторов — работа, беспокойство живот­ного, процесс пищеварения — находит своё отражение в крови, внося в неё порой довольно существенные изменения. Чтобы устранить до некоторой степени влияние этих факторов, затрудняющих правильную оценку картины крови, рекомендуют выработать однообразную метсдику взятия проб крови. Мазки приготовляют в определённое время дня, лучше рано утром, до дачи корма, при строгом учёте указанных влияний.

Фиксация мазка. Наиболее надёжным способом закрепления является фиксация препарата метиловым спиртом. Мазок крови погружают в кюветку с налитым в неё абсолютным метиловым спиртом, покрывают крышкой и выдер­живают в течение 3—5 минут. Способ фиксации в кюветке удобен, потому что допускает одновременную обработку нескольких (до 4) препаратов.

Кроме метилового спирта, пользуются и другими фиксаторами: абсолют­ным этиловым спиртом (20—30 минут), чистым ацетоном (5 минут), смесью, спирта с эфиром в равных пропорциях (10—20 минут), 1% раствором осмие­вой кислоты (V₃—1 час).

Фиксации нагреванием требует лишь окраска по Эрлиху. Обработку пре­паратов жаром производят в сушильном шкафу, температуру которого в тече­ние 1—1'/₂ часов постепенно доводят до 120°. При некотором опыте фиксация удаётся на согревательном столике при помощи спиртовой горелки.

Окраска по Май-Грюнвальду и Лейшману не требует предварительной фиксации, так как закрепляющие элементы содержатся в самой краске.

Окрашивание также требует немало внимания и опыта исследователя. Следует помнить, что прекрасно приготовленный и хорошо фиксированный мазок может быть совершенно испорчен при окраске. Причинами неудач являются то низкие качества краски, то некоторые погрешности методики окра­шивания.

Окраска по Гимза. Пользуются готовым раствором красящего вещества, выпускаемого в продажу под названием краски Гимза. Для окра­шивания одного препарата берут 5 куб. см усреднённой воды, прибавляют к ней 5 капель раствора Гимза и осторожным покачиванием размешивают окрашиваю цуюся в аметистовый цвет жидкость. Препарат помещают на сте­клянных палочках над подставной чашкой, мазком вверх, и покрывают всю его поверхность только что приготовленным раствором.

Красящее вещество постепенно разлагается с выпадением тёмнофиолето-вого осадка, вследствие чего жидкость медленно обесцвечивается. Продолжи­тельность окраски зависит от качества красящего вещества, концентрации раствора, температуры и влажнссти воздуха, а также от качества воды. Летом мазки окрашиваются быстрее (15—20 минут), зимой препарат приходится вы­держивать несколько дольше (20—30—40 минут). По окончании срока раствор краски, значительно уже разложившийся, смывают лёгкой струей усреднён­ной воды, не касаясь препарата руками. Только при этом условии можноизбежать порчи мазка оседающими частицами разложившегося раствора. Хорошо отмытый препарат высушивается в вертикальном положении и затем погружается на несколько секунд в спирт для лучшей диференциации ядра. Не смывая алкоголя, препарат затем быстро высушивают и исследуют под микроскопом.

Правильно окрашенный мазок имеет тонкий красновато-фиолетовый отте­нок. Перекрашенные мазки — густого тёмнофиолетового цвета. Такие же тона дает щелочная окраска. Недокрашенные препараты, а также мазки, обрабо­танные несвободной от кислот дестиллкрованной водой, легко узнать по грубо-красному оттенку их поверхности. Способ Гимза, технически довольно про­стой, даёт прекрасную окраску всех форм белой кро­ви, резко оттеняя присущие им особенности.

Окраска по Май-Грюнвальду. По­верхность мазка покрывают 20—25 каплями раствора Май-Грюнвальда, кстсрый быстро, в течение 3 минут, фиксирует мазок. Так как краска быстро испаряется, нужно следить, чтобы поверхность мазка не высыха­ла. Через 3 минуты краску разводят, приливая 3—5 куб. см нейтрализованной воды, и окрашивают в тече­ние 1 минуты. Спустя минуту водный раствор краски сливают, не смывая дестиллированной водой, остаток удаляют осторожно пропускной бумагой и покрывают поверхность мазка обычным раствором Гимза. Через 20 минут краску смывают струёй усреднённой воды и препарат высушивают.

Рис. 131. Прибор для промывания.

Окраска по Лейшману (Leich.1 ann) являет­ся одним из наиболее удобных и быстрых методов. Предварительной фиксации не требуется. Препарат по­крывают раствором Лейшмана (15—20 капель) на 5 ми­нут, затем, не смывая краски, сстсрсжно приливают по каплям равное количество дестиллированной воды (кап­ля на каплю) и при помощи кисточки осторожно раз­мешивают жидкость. Через 10 минут, раствср краски удаляют струёй дестил­лированной воды. Очистив таким образом, препарат выдерживают в течение 2 минут под слоем воды, споласкивают и высушивают.

Окраска по Эрлиху даёт прекрасное окрашивание зернистости лейкоцитов. Препараты фиксируются сухим жаром при температуре 110—120° в течение одного часа и окрашиваются 10—15 минут триацидом Эрлиха. После смывания краски дестиллкрованнои водой препараты высушиваются на воздухе.

Витальная окраска (по U и л л и н г у) прекрасно выявляет substantia granulo-f larrtntopa в эритроцитах. Для окраски употребляют насы­щенный раствср brillant kresyltlau в аСсолютнсм спирте (1 : 80). Каплю кра­ски наносят на поверхность предметного стекла, чуть подогретого проведе­нием через пламя спиртовой горелки, и затем размазывают так же, как и при приготовлении мазков крови. Распространяясь по стеклу, краска оставляет серовато-фиолетовый налет на поверхности стекла. Обработанные таким обра­зом стёкла довольно долго сохраняются и в нужный момент могут быть всегда использованы.

В момент приготовления мазка на стекло, покрытое высохшей краской, наносят каплю крови, размазывают её обычным способом и затем быстро, пока мазок ещё не подсох, переносят его на 5—10 минут во влажную камеру для окраски substantia granulo-filamentosa. Роль влажной камеры выполняет чашка Коха или небольшой эксикатор, на дно которых положен небольшой кусочек ваты, смоченной водой. Вынутый из камеры мазок высушивают на воз­духе, фиксируют 3 минуты метиловым спиртом и затем окрашивают дополни­тельно обычным способом по Гимза.

Приготовление и окраска толстой капли. Исследо­вание толстой капли производят с целью установить присутствие в крови пара­зитов, особенно при подостро протекающих, а также хронических протозой-ных заболеваниях, когда обычный просмотр мазка не даёт должных результа­тов. Очень удобен также этот метод исследования для определения количества эозинофилов. Иногда им пользуются для подсчёта тромбоцитов, а также выявле­ния некоторых характерных особенностей клеток крови (полихромазия эрит­роцитов).

Рис. 132. Толстая капля.

Для приготовления препарата берут на предметное стекло крупную каплю крови, тотчас же размазывают её препаровальной иглой до величины гривен­ника и высушивают тщательно на воздухе в течение нескольких ча­сов. Для окраски применяют оэыч-ный раствор Гимза, которым по­крывают хорошо высушенный не­фиксированный мазок. Краска бы­стро гемолизирует эритроциты и, разлагаясь, даёт красное облачко на поверхности жидкости. Чтобы избе­жать выпадения осадка, раствор Гимза через 3 минуты, т. е. после того как закончился гемолиз, осторожно сливают, приподнимая для этого слегка один край чашки, над которой производится обработка мазка. Остатки пер­вой порции краски смывают, осторожно приливая сбоку только что приготовлен­ный новый раствор Гимза (1 капля на 1 куб. см воды), затем снова, опустив чашку, придают мазку горизонтальное положение, осторожно покрывают его поверх­ность свежим раствором и окрашивают в .течение 25—30 минут. С теми же пре­досторожностями, стараясь не попортить поверхности толстой капли, смывают, наконец, краску лёгкой струёй воды и высушивают препарат, придав ему вер­тикальное положение.

При удачной обработке сергдина капли окрашивается в синеватый или голубоватый цвет, в то время как края её получают красновато-фиолетовый отте­нок. Грязнофиолетовая окраска получается в сильно перекрашенных препа­ратах, а так-ке при щелочной реакции воды.

В правильно окрашенной толстой капле должны быть достаточно ясно выражены характерные особенности каждой клетки. При плохой окраске картина неясная: ядра клеток очень плохо выражены, зернистость не отчётлива, тромбоциты еле заметны.