Автореферат-06.07.2014

хроматографию (НФ-ВЭЖХ и ОФ-ВЭЖХ), газовую капиллярную колоночную хроматографию с масс-селективным детектированием (ГХ-МС), нормальнофазовую и обращеннофазовую жидкостную макроколоночную хроматографию низкого давления (НФ-Кл и ОФ-Кл).

Хроматографирование методом НФ-ТСХ проводили на пластинах «Сорбфил УФ-254» (сорбент – СТХ-1ВЭ), «Silufol UV-254» (сорбент – широкопористый силикагель по Питри), ОФ-ТСХ (модель привитой алкильной фазы С14-С15 на силикагеле СТХ-1ВЭ). Использованы моно-, би- и многокомпонентные подвижные фазы. Установлены зависимости абсолютной хроматографической подвижности исследуемых веществ от диэлектрической проницаемости элюента (метод НФТСХ).

Для всех подвижных фаз рассчитаны показатели хроматографической подвижности. Оптимальные условия хроматографирования методом ТСХ представлены в таблице 2. Как видно из таблицы 2, предлагаемые хроматографические системы позволяют разделить и идентифицировать анализируемые вещества.

Таблица 2 – Абсолютная хроматографическая подвижность (Rf) нимесулида (НМС) и близких по структуре соединений в оптимальных элюентах

Оптимальные условия хроматографирования методом НФ-ВЭЖХ (колонка 100×2 мм, сорбент «Silasorb-600») для нимесулида, 4-НА, 4-Н-2-ФА достигаются в элюенте гексан-ацетон-тетрахлорметан (7:3:7), для нимесулида, 4-А-2-ФФМСА, 4- МСА-3-ФФА, 4-Г-2-ФФМСА – в элюенте гексан-диоксан-тетрахлорметан (1:1:1). Результаты представлены на рисунке 2.

Оптимальные результаты хроматографирования методом ОФ-ВЭЖХ

(колонка 250×4,6 мм, сорбент «Luna C18 5 мкм 100Å Phenomenex®») для аналитов достигаются при использовании подвижной фазы состава: В,% - С,%; В – 20 мМ фосфатный буфер KH2PO4 с рН 3,05; С – ацетонитрил; градиентный режим: 0,01…12,2 мин – В 65%; 12,2…13,0 мин – В 65…55%; 13,0…22,0 мин – В 55%; 22,0…23,0 мин – В 55-65%; 23,0…25,0 мин – В 65% (рисунок 3).

Как видно из таблицы 3, разработанные методики количественного анализа исследуемых соединений методом ВЭЖХ достаточно воспроизводимы и правильны. Относительная ошибка среднего результата не более 1,41%.

11

По результатам хроматографирования исследуемых соединений методами НФ-Кл в системах гексан-ацетон, толуол-ацетонитрил и ОФ-Кл в системах водаацетон, вода-ацетонитрил определен ряд оптимальных подвижных фаз, применимых для очистки извлечений из биологического материала. В вышеуказанных системах установлены зависимости объемов удерживания аналитов от количества слабого элюирующего компонента в составе элюента.

ГХ-МС исследуемых соединений проводили с использованием капиллярной колонки DB-5 MS EVIDEX (25м×0,2мм). Характерные времена удерживания исследуемых веществ и сигналы осколков в масс-спектрах позволяют идентифицировать анализируемые вещества с высокой селективностью.

12

При исследовании аналитов методами НФ-ВЭЖХ, ОФ-ВЭЖХ, НФ-Кл, ОФКл определены и рассчитаны параметры хроматографирования: объем удерживания (VR); объём удерживания неудерживаемого компонента (V0); время удерживания (tR); время удерживания неудерживаемого компонента (t0); ширина пика у основания (ω); скорость истечения элюента (υ); коэффициент асимметрии пика (AS); число теоретических тарелок (N); высота, эквивалентная теоретической тарелке (Н); приведенная высота, эквивалентная теоретической тарелке (H'); абсолютный и относительный коэффициенты емкости (k') и (k'st) (для 4-Н-2-ФА и нимесулида относительно 4-нитроанилина, для 4-А-2-ФФМСА и 4-МСА-3-ФФА – относительно 4-Г-2-ФФМСА); относительный фактор емкости (Fk'); относительное изменение свободной энергии при адсорбции (∆(∆G)). Дополнительно для смежных пиков в методах НФ-ВЭЖХ и ОФ-ВЭЖХ рассчитаны степень разделения (iвэжх) и разрешение пиков (Rs).

Таблица 3 – Результаты определения нимесулида и близких по структуре соединений нормальнофазовой НФ-, обращеннофазовой ОФ-ВЭЖХ (n=6; Р=0,95)

Оптимальной при хроматографировании в колонке нормальнофазового сорбента (Silicagel L 40/100 мкм) нимесулида, 4-нитроанилина, 4-Н-2-ФА является подвижная фаза гексан-ацетон (8:2), при хроматографировании 4-А-2-ФФМСА, 4- МСА-3-ФФА, 4-Г-2-ФФМСА – подвижная фаза гексан-ацетон (6:4).

Оптимальной при хроматографировании в колонке обращеннофазового сорбента (Silasorb C18 30 мкм) 4-нитроанилина является подвижная фаза вода-

ацетон (9,5:0,5), 4-Г-2-ФФМСА и 4-МСА-3-ФФА – вода-ацетон (8,5:1,5), 4-А-2-

ФФМСА – вода-ацетон (8:2), 4-Н-2-ФА – вода-ацетон (5:5), нимесулида – вода-

ацетон (5,5:4,5).

Рассмотрена возможность использования хроматографии в тонких слоях и макроколонках сорбентов, а также жидкость-жидкостной экстракции для очистки исследуемых веществ в извлечениях из биоматериала.

13

Изучены зависимости экстрагирования аналитов из водных растворов гидрофобными органическими растворителями. Определены оптимальные условия максимального извлечения аналитов из равновесных водной и органических фаз (экстрагенты – этилацетат, этилацетат насыщенный водой, бензол; электролиты – аммония сульфат, аммония бромид, натрия бромид). Определены условия селективного экстрагирования нимесулида, 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА при совместном присутствии в анализируемой пробе. Рассчитана необходимая кратность экстрагирования заданных количеств исследуемых соединений из водных растворов.

По результатам изучения хроматографической подвижности и характера экстрагируемости аналитов предложено 7 различных вариантов схем очистки извлечений из биоматериала. Потери изучаемых веществ при моделировании очистки хроматографическими методами не превышают 0,42%. На контрольных образцах извлечений из биоматериала экспериментально установлена наилучшая эффективность очистки методами, сочетающими экстракцию и жидкостную колоночную хроматографию (нормальная или обращенная фаза).

Определен характер извлечения аналитов из биоматериала 32 изолирующими агентами различных химических групп, в т. ч. их смесями. Ряд лучших изолирующих агентов представлен на рисунке 4 (n=5; Р=0,95).

Алифатические спирты, сложные эфиры карбоновых кислот и ацетон

R, %

100 90 80 70

60 50

40 30 20 10 0

Обозначения: Мет – метанол, Эт – этанол, Пр-1 – пропанол-1, Пр-2 – пропанол-2, Бут-1 – бутанол-1, изо-Бут – изо-бутанол, МетАц – метилацетат, ЭтАц – этилацетат, ПропАц – пропилацетат, БутАц – бутилацетат, ДХМ – дихлорметан, ТХМ – трихлорметан, ТетрХМ

– тетрахлорметан, 1,2ДХЭ – 1,2-дихлорэтан, Бенз – бензол, Тол – толуол, о-Кс – о-ксилол, Смесь1 – 1,4-диоксан-ацетон (мас. 1:1), Смесь2 – ацетонитрил-ацетон (мас. 1:1), Смесь3 – 1,4-диоксан-ацетонитрил (мас. 1:1), Смесь4 – 1,4-диоксан-ацетон-ацетонитрил (мас. 1:1:1)

Рисунок 4 – Сравнительное изолирование аналитов из биоматериала

Для всех исследуемых соединений оптимальным изолирующим агентом выбран ацетон. Исследована зависимость степени извлечения аналитов из биоматериала ацетоном от объема ацетона, продолжительности и кратности настаивания. Оптимальные условия изолирования: двукратное настаивание не менее 45 минут, массовое соотношение «ацетон-биоматериал» – не менее 2:1.

14

Как видно из таблицы 4, исследуемые соединения в значительных количествах присутствуют в верхних отделах желудочно-кишечного тракта, а также в крови, почках с надпочечниками и легких (4-нитроанилин), в мозге и тимусе (4-Н-2-ФА), в почках с надпочечниками и легких (нимесулид), в глазах и тимусе (4-А-2-ФФМСА), в тимусе и селезенке (4-Г-2-ФФМСА), в селезенке, крови, сердце и почках с надпочечниками (4-МСА-3-ФФА как индивидуальное вещество), в глазах, селезенке, сердце и почках с надпочечниками (4-МСА-3-ФФА как метаболит 4-А-2-ФФМСА).

Таблица 4 – Результаты распределения изучаемых веществ в организме теплокровных животных (крысы) (n=5; Р=0,95)

16

Всоответствии с полученными данными доказано наличие процессов восстановления нимесулида в гнилостно-разлагающемся трупном материале до 4- А-2-ФФМСА и ацетилирования образовавшегося 4-А-2-ФФМСА до 4-МСА-3- ФФА. Установлено, что трансформация 4-А-2-ФФМСА в трупном материале при достаточно низких температурах возможна по двум направлениям – ацетилирование до 4-МСА-3-ФФА или окисление до нимесулида.

Врассмотренных условиях сроки сохранения анализируемых веществ составили: нимесулида и 4-НА – 34-590 суток, 4-А-2-ФФМСА – 270-540 суток, 4- МСА-3-ФФА – 240-540 суток, 4-Н-2-ФА и 4-Г-2-ФФМСА – как минимум 240 суток. В процессе трансформации нимесулида в трупном материале на 4-130 сутки образуется 4-А-2-ФФМСА, а на 18-130 сутки – МСА-3-ФФА, которые затем можно обнаружить в модельных смесях в течение 320-590 и 230-590 суток соответственно. В процессе трансформации 4-А-2-ФФМСА в трупном материале на 24-34 сутки образуется 4-МСА-3-ФФА, который затем обнаруживается в модельных смесях до 540 суток.

Рисунок 6 – Результаты изучения сохраняемости нимесулида при различных температурах (А, Б, В, Г, Д) и 4-А-2-ФФМСА при -12 °С (Е).

17

ВЫВОДЫ

1.Проведен подбор условий синтеза и очистки 4-Н-2-ФА и 4-А-2-ФФМСА из нимесулида, а также 4-МСА-3-ФФА и 4-Г-2-ФФМСА из 4-А-2-ФФМСА. Доказана индивидуальность синтезированных соединений методами ТСХ и ГХМС, установлена их химическая структура с использованием методов ЯМР 1Н и ИК-спектрофотометрии. Количественное содержание основных веществ в синтезированных и очищенных образцах определялось титриметрическими методами. Определены величины химических сдвигов протонов в ЯМР 1Н спектрах исследуемых соединений. Рассчитан ряд оптических характеристик электронных спектров анализируемых соединений. Показана возможность идентификации данных веществ по их электронным, ИК-, масс-спектрам (ГХ-МС).

2.Исследовано хроматографическое поведение анализируемых веществ в тонких слоях и колонках неподвижных фаз с гидроксилированной и привитой поверхностями с применением элюентов различной полярности. Рассчитаны параметры хроматографирования анализируемых соединений. Установлено, что оптимальной для определения нимесулида и близких по структуре соединений в тонких слоях силикагеля (пластины «Сорбфил» УФ-254) является подвижная фаза толуол-ацетонитрил (7:3). При определении в тонких слоях обращённофазового сорбента (модель привитой фазы С14 – С15) оптимальной является подвижная фаза буферный раствор с рН 8,95 - метанол (7:4).

Показано, что оптимальной для определения нимесулида, 4-нитроанилина, 4- Н-2-ФА методом нормальнофазовой ВЭЖХ является подвижная фаза гексан- ацетон-тетрахлорметан (7:3:7), для определения нимесулида, 4-А-2-ФФМСА, 4- МСА-3-ФФА, 4-Г-2-ФФМСА – подвижная фаза гексан-диоксан-тетрахлорметан (1:1:1). Установлено, что для определения исследуемых соединений методом обращеннофазовой ВЭЖХ универсальным является градиентный режим элюирования с компонентами подвижной фазы ацетонитрилом и 20 мМ фосфатным буфером KH2PO4 с рН 3,05.

3.Разработаны методики количественного спектрофотометрического определения аналитов по поглощению в средах ацетонитрила, ДМФА и этанола. Относительная ошибка среднего результата (n=6; Р=0,95) методик не превышает 1,04 %. Разработаны методики количественного определения аналитов методами нормальнофазовой и обращеннофазовой ВЭЖХ. Относительная ошибка среднего результата (n=6; Р=0,95) – не более 1,41 %.

4.Установлены оптимальные условия максимального извлечения аналитов из равновесных водной и органических фаз (экстрагенты – этилацетат, этилацетат насыщенный водой, бензол; электролиты – аммония сульфат, аммония бромид, натрия бромид). Определена необходимая кратность экстрагирования для извлечения заданных количеств аналитов из водных растворов. Предложены селективные условия экстрагирования нимесулида, 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА при их возможном совместном присутствии.

5.Исследована зависимость удерживания аналитов в макроколонках нормальнофазового (Silicagel L 40/100 мкм) и обращеннофазового (Silasorb C18 30 мкм) сорбентов от состава и соотношения компонентов подвижных фаз. Установлены оптимальные условия хроматографирования исследуемых соединений с использованием подвижных фаз состава: гексан-ацетон (нормальнофазовый сорбент) и вода-ацетон (обращеннофазовый сорбент).

18

Определён уровень потерь аналитов при хроматографировании в тонких слоях и колонках сорбентов. Показана эффективность разработанных способов очистки анализируемых соединений от соэкстрактивных веществ биоматериала жидкость-жидкостной экстракцией и хроматографией.

6.Изучено сравнительное изолирование аналитов из биоматериала 32 изолирующими агентами различной химической природы в режиме настаивания. Установлены зависимости степени изолирования анализируемых соединений от длины углеводородного радикала в ряду алифатических спиртов и сложных эфиров карбоновых кислот, от числа атомов хлора в ряду галогеналканов, от молекулярной массы аренов.

Установлено, что извлечение анализируемых веществ из биоматериала целесообразно проводить ацетоном. Оптимальные условия изолирования достигаются при двукратном настаивании в течение как минимум 45 минут при массовом соотношении «ацетон-биоматериал» – не менее 2:1.

7.Разработаны методики определения анализируемых соединений в тканях трупных органов и биожидкостях (крови, плазме крови и моче) на основе изолирования ацетоном и последующей очистки жидкость-жидкостной экстракцией и хроматографией.

Установлено, что при росте содержания аналитов от 2,0 до 50,0 мг в 100 г биоматериала изменение степени извлечения не превышает 3,59 %. Значения

степени извлечения при этом находятся в интервале 48,73-99,90%, а значения доверительного интервала – 1,56-6,95 (n=5; Р=0,95). Для разработанных методик установлены значения определяемого минимума исследуемых веществ.

8. Исследовано распределение рассматриваемых соединений в организме теплокровных (на примере крыс). Установлено, что в значительных количествах исследуемые соединения присутствуют в верхних отделах желудочно-кишечного тракта, а также в крови, почках с надпочечниками и легких (4-нитроанилин), в мозге и тимусе (4-Н-2-ФА), почках с надпочечниками и легких (нимесулид), глазах и тимусе (4-А-2-ФФМСА), селезенке, крови, сердце, почках с надпочечниками (4- МСА-3-ФФА), тимусе и селезенке (4-Г-2-ФФМСА).

Исследованы особенности сохранения нимесулида, продуктов его трансформации и близких по структуре соединений в модельных смесях с трупным материалом в пяти температурных режимах (от -12 до 36 °С). Доказана возможность трансформации в трупном материале нимесулида до 4-А-2-ФФМСА и 4-МСА-3-ФФА, а 4-А-2-ФФМСА до 4-МСА-3-ФФА.

19

Список работ, опубликованных автором по теме диссертации

1.Шорманов, В. К. Определение изомеров нитроанилина в тонком слое нормальнофазового сорбента / В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов, А. С. Шилова // Биотехнология. Биомедицинская инженерия и технология современных социальных практик : сб. тр. Всерос. науч.-практ. конф. – Курск : Изд-во КГМУ, 2009. – С. 171-174.

2.Шорманов, В. К. Изучение особенностей определения изомеров нитроанилина методом нормальнофазовой ТСХ после переведения их в соответствующие полинитропроизводные / В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов, А. С. Шилова // Биотехнология и биомедицинская инженерия : сб. материалов III Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием, посвящ. 75-летию Курск. гос. мед. ун-та.

–Курск : Изд-во КГМУ, 2010. – С. 323-325.

3.Возможности применения электронной спектрофотометрии для

идентификации нимесулида в биологических жидкостях / В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов, О. И. Гришечко, С. Г. Галушкин // Биотехнология и биомедицинская инженерия : сб. материалов IV Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. – Курск : Изд-во КГМУ, 2011. – С. 213-215.

4.Идентификация 4-нитроанилина методом электронной

спектрофотометрии / В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов, Л. Е. Сипливая, О. И. Гришечко // Биотехнология и биомедицинская инженерия : сб. материалов IV Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. – Курск : Изд-во КГМУ, 2011. –

С. 215-217.

5. Количественное определение 4-нитроанилина на основе поглощения в среде ацетонитрила / В. К. Шорманов, Л. Е. Сипливая, Д. А. Герасимов, О. И. Гришечко // Биотехнология и биомедицинская инженерия : сб. материалов IV Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. – Курск : Изд-во КГМУ, 2011. –

С. 220-223.

6.Количественное определение 4-нитроанилина на основе поглощения электромагнитного излучения в среде ДМФА / В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов, О. И. Гришечко, С. Г. Галушкин // Биотехнология и биомедицинская инженерия : сб. материалов IV Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. – Курск : Изд-

во КГМУ, 2011. – С. 211-213.

7.Количественное определение нимесулида методом спектрофотометрии в УФ-области / В. К. Шорманов, Л. Е. Сипливая, Д. А. Герасимов, С. Г. Галушкин // Университетская наука: Взгляд в будущее : материалы итоговой науч. конф. сотрудников КГМУ (2-3 февр. 2011 г.) : в 3 т. – Курск : Изд-во КГМУ, 2011. – Т. 2.

–С. 292-294.

8.Определение нимесулида методом электронной спектрофотометрии / В. К. Шорманов, Л. Е. Сипливая, Д. А. Герасимов, О. И. Гришечко // Университетская наука: Взгляд в будущее : материалы итоговой науч. конф. сотрудников КГМУ (2-3

февр. 2011 г.) : в 3 т. – Курск : Изд-во КГМУ, 2011. – Т. 2. – С. 294-297.

9.Особенности определения отдельных нитропроизводных анилина в

биологический объектах в тонком слое обращеннофазового сорбента / В. К. Шорманов, А. С. Шилова, Ю. А. Сухомлинов, Д. А. Герасимов // Сорбционные и хроматографические процессы. – 2011. – Т. 11, вып. 3. – С. 407414.

20