skok_m_v_osnovi_imunologi_kurs_lekciy

51

диференціювання ЦТЛ. Рецептори до ІЛ-6 знаходяться також на нервових клітинах, де цей цитокін проявляє свою нейротрофну дію.

ІЛ-7: продукується клітинами строми кісткового мозку і тимусу. Має значення для розвитку імунних клітин, викликає проліферацію ранніх про-В, пре-В та попередників Т лімфоцитів.

ІЛ-8: продукується моноцитами, лімфоцитами, а також фібробластами, клітинами шкіри і ендотеліальними клітинами. Є хемоатрактантом для нейтрофілів, базофілів, Т лімфоцитів.

ІЛ-9: продукується стимульованими Т хелперами. Викликає проліферацію Т лімфоцитів і тучних клітин.

ІЛ-10: продукується Т лімфоцитами і моноцитами, стимульованими ліпополісахаридом. Є антагоністом γ-інтерферону та ІЛ-2, супресує ефекторні функції макрофагів, знижує рівень експресії антигенів МНС ІІ. Викликає проліферацію В клітин, тимоцитів і тучних клітин, диференціювання В лімфоцитів в клітини, що секретють IgG4.

ІЛ-11: продукується клітинами строми кісткового мозку і фібробластами. Посилює синтез антитіл В клітинами і стимулює розвиток клітин крові.

ІЛ-12: продукується активованими В лімфоцитами і моноцитами. Один із найбільш сильних стимуляторів природних кілерів. Впливає також на активацію цитотоксичних Т лімфоцитів.

ІЛ-13: продукується активованими Т лімфоцитами. Пригнічує продукцію запалювальних цитокінів моноцитами; стимулює проліферацію В лімфоцитів і секрецію ними антитіл.

ІЛ-14: продукується Т лімфоцитами. Посилює проліферацію активованих В лімфоцитів і пригнічує біосинтез імуноглобулінів.

ІЛ-15: продукується багатьма типами клітин; повторює багато властивостей ІЛ-12, тобто викликає проліферацію цитотоксичних Т лімфоцитів і природних кілерів.

Цитокіни, не є елементами суто імунної системи і регулюють багато інших процесів, таких як кровотворення, запалення, пухлинний ріст і ріст тканин взагалі, а також ембріональний розвиток і нейоро-ендокринні процеси.

Як вже зазначалося, для цитокінів характерні дві важливі риси:

1)функціональна виродженість, яка означає, що дана біологічна функція, як правило, регулюється більше, ніж одним цитокіном;

2)багатофункціональність кожного цитокіну.

Ці дві риси мають певну аналогію із поліспецифічністю і гетерогенністю імуноглобулінів. Вони означають, що надійність системи в цілому – це інтегральна величина, яка залежить від сумарної дії декількох факторів, що можуть до певної міри заміщати один одного. Це було добре продемонстровано на прикладі мишей дефектних по гену ІЛ-2. Незважаючи на ключову роль цього цитокіну в розвитку і активації імунних клітин, миші, що не мали гену ІЛ-2, виявилися цілком нормальними: у них функцію ІЛ-2 взяли на себе інші цитокіни. А ось коли створили мишей, дефектних по гену рецептору до ІЛ-2, у них було знайдено серйозні зміни в функціонуванні імунної системи: Т клітини були анергізовані, а В

– швидко диференціювалися, не маючи сигналів, що стримували б їх диференціювання. Ці експерименти означали, що ключову роль в регуляції імунних процесів відіграє саме рецептор, який передає належну інформацію всередину клітини, а ліганд (цитокін) може бути замінений.

3. Рецептори до цитокінів.

52

Кожний цитокін має свій специфічний рецептор, як правило, високої афінності. Кількість рецепторів на клітину становить від 102 до 104 і зростає при активації клітини.

По структурі рецептори до цитокінів ділять на чотири типи. Поєднує їх те, що більшість із них олігомерні, тобто складаються із декількох субодиниць, причому одні й ті ж самі субодиниці часто входять до складу декількох рецепторів. Так, рецептор до ІЛ-2 складається із α, β, γ субодиниць; β ланцюг входить також у склад рецептору до ІЛ-15, а γ − у склад рецепторів до ІЛ-4, ІЛ-7 і ІЛ-9. Таким чином, багатофункціональність цитокінів може бути частково поясненою наявністю спільних субодиниць у відповідних рецепторах.

Тип І – це рецептори до ІЛ-2, 3, 4, 5, 7, 9. За своєю будовою вони схожі до фібронектину – адгезивного глікопротеїну позаклітинного матриксу. Вони характеризуються наявністю двох надклітинних доменів, перший із яких прошитий дисульфідними зв’язками, а другий має примембранний мотив, що містить залишки триптофану і серину. Рецептори до ІЛ-6 і 12 мають ще додатковий N- кінцевий домен. При загальній подібності надклітинних частин, ці рецептори мають зовсім різні внутрішньоклітинні частини і, відповідно, передають кожний свої сигнали. У них є єдина загальна функція – мітогенна.

Тип ІІ – це рецептори до γ-інтерферону та ІЛ-10. Їх надклітинна частина складається також із двох доменів, кожен з яких прошитий двома дисульфідними зв’язками.

Тип ІІІ – це багаті на цистеїн рецептори до TNFα і β, NGF (фактору росту нервів), CD40L, Fas (рецептору апоптозу).

Тип IV – це білки суперродини імуноглобулінів. Вони мають три надмембранних імуноглобуліноподібних домени. До цього типу відносяться рецептори до ІЛ-1 (α, β), а також мембранні форми ІЛ-6 та 7.

Треба зазначити, що як цитокіни можуть знаходитися в розчинній і в мембранозв’язаній формі, так і їхні рецептори теж мають розчинні форми. Наприклад, ІЛ-2 зв’язується із високоафінним рецептором, що складається із двох субодиниць, 75 і 55 КДа. Після активації Т клітин через ІЛ-2-рецептор частина субодиниць 55КДа звільняється із мембрани і стає розчинним ІЛ-2-рецептором. Про біологічні функції розчинних рецепторів відомо мало. Вважають, що вони можуть зв’язувати надлишок цитокіну, що циркулює.

Рецептори до цитокінів мають гомологію із деякими онкогенами. Наприклад, протоонкоген c-kit кодує рецептор до ростового фактору стовбурових клітин. А єдина амінокислотна заміна аргінін-серин в рецепторі до еритропоетину призводить до безконтрольної активації відповідної клітини і, як наслідок, до утворення злоякісної пухлини. Це ще один приклад того, що злоякісні перетворення є наслідком порушень у контролі за ростом і проліферацією клітин.

Багатофункціональність рецепторів пояснюється тим, що з одним рецептором можуть співпрацювати різні типи тирозинових кіназ. Специфічність сигналу контролюється на декількох рівнях:

1)будова внутрішньоклітинних частин рецептору визначає, з якими кіназами він потенційно може взаємодіяти;

2)конкретний тип кіназ і сигнальних каскадів, що вони запускають, залежить

від щільності рецепторів на поверхні клітини (мало рецепторів – один шлях, багато – інший).

З рецепторами до цитокінів зв’язані тирозинові кінази третьої родини – кінази Януса (Jak). Jak-кінази фосфорилюють цитоплазматичні білки Stat; Stat утворюють гомоабо гетеродимери і мігрують до ядра, де вони діють як транскрипційні

53

фактори. Різні Stat-білки знаходяться під різними рецепторами, хоча останні можуть бути зв’язані із однаковими Jak-кіназами. Таким чином, кінази Януса, подібно до одноіменного бога, дволикі: одна і та сама Jak фосфорилює різні Stat під різними рецепторами. Наприклад, під рецепторами до ІЛ-2 і 4 стоять однакові кінази Jak 1 і 3, але різні Stat, і навпаки, активація рецепторів до ІЛ-2 і гормону пролактіну призводить до фосфорилювання Stat 5, але це виконують різні Jak.

Резюме.

Активація лімфоцитів потребує наявності декількох активаційних сигналів, дія яких зближує клітини і збільшує авідність їхньої взаємодії. Під впливом хемокінів відбуваються зміна властивостей адгезивних молекул і перегрупування мембранних білків. Цитокіни сприяють експресії на мембрані костимуляторних молекул. Костимуляторні молекули зближують антиген-специфічний рецептор Т лімфоцитів і МНС клітини, що представляє антиген. За наявності компліментарності представленого антигенного пептиду і Т рецептору утворюється імунний сінапс, що сприяє проходженню активаційного сигналу всередину клітин, що взаємодіють. Відсутність одного із активаційних сигналів може призвести до анергізації клітини або її загибелі (апоптозу).

Цитокіни є одним із важливих факторів розвитку і активації імунних клітин. Вони діють на відстані, але, як правило, впливають на ті клітини, що зближені за рахунок інших взаємодій. В залежності від функції, цитокіни класифікують на декілька категорій, хоча ефекти різних цитокінів можуть перекриватися. Вони діють на специфічні рецептори, які зв’язані внутрішньоклітинно із тирозиновими кінізами Януса і транскрипційними факторами Stat. Цитокіни є важливим фактором, що пов’язує імунну систему із іншими системами організму, перш за все, нервовою і ендокринною. Наприклад, дія цитокіну ІЛ-1 на специфічні рецептори, розташовані на клітинах мозку, викликає відчуття, характерні для стану запалення: лихоманку, головний біль.

Лекція 9. Цитокіни і регуляція імунної відповіді.

Цю лекцію буде присвячено розгляду конкретних прикладів участі цитокінів в активації Т лімфоцитів і регуляції імунної відповіді. Як було зазначено у вступній лекції, Т лімфоцити, поділяють на два головні підтипи: Т-хелпери (Тх) і Т-кілери, або цитотоксичні Т лімфоцити (ЦТЛ). Тх мають на своїй мембрані корецептор CD4, що є їх специфічним маркером, впізнають антиген у комплексі з МНС ІІ і виконують регуляторну роль в імунній відповіді: активують В лімфоцити для диференціювання в плазматичні клітини і секреції антитіл і, відповідно, попередників ЦТЛ для виконання цитотоксичної дії. ЦТЛ мають корецептор CD8, впізнають антиген у комплексі з МНС І і за наявності сигналу від Тх виконують цитотоксичну ефекторну функцію – знищують інфіковані клітини. Відповідно, активація Тх і ЦТЛ потребує різних активаційних сигналів і призводить до різних метаболічних подій.

1. Активація Тх.

До зустрічі з антигеном Тх знаходяться у спокої. Це так звані малі лімфоцити, що можуть жити в організмі на протязі років. Вони експресують на своїй поверхні антиген-специфічний рецептор (Т-рецептор), фосфатазу CD45, яка знаходиться поблизу Т-рецептору, але не асоційована з ним, низький рівень CD40L і низькоафінний рецептор до ІЛ-2, що складається із субодиниць β і γ.

Після зустрічі з антигеном, представленим із білками МНС ІІ, у Т лімфоциті починається експресія гену α-субодиниці рецептору до ІЛ-2 і в результаті

54

утворюється високоафінний рецептор. Взаємодія його із екзогенним ІЛ-2 проштовхує Т лімфоцит по клітинному циклу; він починає ділитися і утворює клон. Крім того, взаємодія з ІЛ-2 призводить до підвищення експресії CD40L. Після взаємодії такої клітини із В лімфоцитом у В лімфоциті підвищується експресія костимуляторних молекул В7.1 і В7.2. Взаємодія В7.1 із CD28 на поверхні Т лімфоциту призводить до стабілізації мРНК ІЛ-2, посилення синтезу ІЛ-2 і посилення транскрипції гену ІЛ-2. В результаті рівень секреції ІЛ-2 підвищується приблизно в 100 разів і клітина активує як сама себе (аутокринно), так і сусідні клітини (паракринно). Взаємодія Т-рецептору з антигеном призводить також до конформаційних змін в молекулі LFA-1, що зміцнює адгезивний зв’язок Т лімфоциту і клітини, що презентує антиген.

В результаті всіх цих взаємодій через 4-5 днів Т клітина переходить у стан активації. Він характеризується підвищеним рівнем експресії адгезивних і костимуляторних молекул, а також експресією іншої форми CD45 – CD45RO, що утворюється в результаті альтернативного сплайсингу мРНК. Така форма CD45 ассоціює із Т-клітинним рецептором і сприяє проходженню активаційного сигналу від антигену. Тепер для відповіді на антиген для Т клітини не потрібні костимуляторні сигнали.

Таким чином, під дією антигену неактивовані Т лімфоцити спочатку починають проліферувати, а потім перетворюються на активовані клітини. Далі їх функціонування залежить від спектру цитокінів, що продукуються під дією антигену.

2. Популяції регуляторних Т лімфоцитів.

Як обговорювалось у попередніх лекціях, тип імунної відповіді: клітинний чи гуморальний, - визначається типом антигену і характером його процесингу. Однак більшість природних патогенів, бактерій, вірусів, паразитів, є комплексними антигенами, що мають як ендогенні, так і екзогенні елементи. Важливим елементом регуляції імунної відповіді, зокрема вирішення, яким шляхом, гуморальним чи клітинним піде відповідь, є участь певних типов хелперних Т клітин, так званих Т-

хелперів 1 (Tх1) і Т-хелперів 2 (Tх2).

Цього висновку дійшли вивчаючи захворювання мишей, викликане протозойною інфекцією лейшманії. Виявилося, що миші двох генетичних ліній були по-різному чутливі до лейшманії: миші BALB/c хворіли, а C57Bl/6 – ні. В крові цих мишей було знайдено різні рівні двох важливих цитокінів: BALB/c мали високі рівні ІЛ-4 і низькі – γ-інтерферону (ІФН), а C57Bl/6, навпаки, низькі рівні ІЛ-4 і високі – ІФН.

Подібну картину знайшли вивчаючи, як протікає у людей захворювання на проказу (лепру). У одних воно протікає у так званій лепроматозній формі, коли іде активне ураження тканин і виявляється багато внутрішньоклітинних паразитів; у таких людей було знайдено високі рівні ІЛ-4. У інших проказа протікає у так званій туберкулоїдній формі, коли паразитів як таких визначається мало, а ураження відбувається за рахунок імунного запалення; у таких людей було виявлено високі рівні ІФН.

При довгостроковому клонуванні CD4+ Т клітин в культурах було знайдено два типи клонів, що відрізнялися за спектром цитокінів: одні секретували γІФН, ІЛ-2 і,

ФНПα (фактор некрозу пухлин, TNF) ; інші – ІЛ-4, 5, 6, 10, 13. Їх і було названо відповідно Тх1 і Тх2 (Рис. 18).

Виявилося, що Тх1 і Тх2 виконують різні функції. Тх1 – стимулюють мікробіцидну активність макрофагів, клітинний імунітет (ЦТЛ); не стимулюють активацію В лімфоцитів у спокої, але в активованих В клітинах сприяють секреції

55

IgG2a, тобто функціонують у вторинній гуморальній імунній відповіді. Тх2 – стимулюють проліферацію та диференціювання В клітин, переключення із IgM на IgE, IgG1, IgG3. Функціонують як у первинній, так і у вторинній гуморальній імунній відповіді.

Отже, наявність Тх1 у мишей C57Bl/6 і у людей із туберкулоїдною формою прокази сприяла знищенню внутрішньоклітинних паразитів шляхом клітинного імунітету, а у мишей BALB/c і людей із лепроматозною форми прокази наявність Тх2 сприяла гуморальній імунній відповіді без знищення уражених клітин.

Розвиток Тх1 чи Тх2 із попередника залежить від спектру цитокінів, що присутні при їх диференціюванні. Так, попередник Тх, що утворився при активації Т лімфоциту із стану спокою (CD4+, секретує ІЛ-2) диференціюється у Тх0 , що секретує як ІЛ-4, так і ІФНγ. При появі антигену, що провокує секрецію тих чи інших цитокінів, спостерігається розгалуження на Тх1 і Тх2. Інфіковані макрофаги секретують ІЛ-12, який разом із ІЛ-2 сприяє утворенню Тх1 (цей процес інгибується ІЛ-4). Антиген, опсонізований антитілами, зв’язує Fc-рецептори на базофілах, тучних клітинах і СD4+ Т клітинах, які є джерелом IL-4, що сприяє утворенню Тх2 (ІФНγ інгибує цей процес).

Таким чином, шлях розвитку імунної відповіді, клітинний чи гуморальний, залежить від того, секрецію яких лімфокінів провокує той чи інший антиген. На молекулярному рівні це зводиться до вибіркової транскриції генів ІЛ-4 чи ІФНγ. Бактеріальні антигени активують переважно Тх1, а гельмінтозні інфекції – переважно Тх2. Як правило, інфекції провокують відповідь не чистого Тх1 чи Тх2 типу. Наприклад, вірус грипу стимулює продукцію як ІФН, так і ІЛ-10, але пригнічує продукцію ІЛ-5 та ІЛ-4. Також, вибір між Тх1 і Тх2 генетично детермінований, що видно на прикладі різних ліній мишей, інфікованих лейшманією.

Для розвитку Тх1 IЛ-4, що продукується Тх2, є негативним сигналом. Для розвитку Тх2, навпаки, необхідний IЛ-4, а IФНγ, що продукується Тх1, є негативним сигналом. Це означає, що Тх1 і 2 є взаємно антагоністичними: активність Тх1 пригнічує розвиток Тх2, а Тх2 пригнічують розвиток Тх1. У зрілому стані Тх1 і 2 теж взаємно пригнічують одне одного.

Молекулярні основи такого антагонізму з’ясовані не до кінця. Відомо, наприклад, чому Тх2 пригнічуються IФНγ, а Тх1 – ні. IФНγ взаємодіє із специфічним рецептором, що складається із α і β ланцюгів. Взаємодія з рецептором призводить до активації тирозинових кіназ Jak1 і Jak2, які фосфорилюють Stat 1. Stat 1 димеризується, мігрує до ядра і стимулює транскрипцію гену IФНγ. В Тх1 β−ланцюг рецептору до IФНγ відсутній. Таким чином, Тх1 використовують модифікацію рецептору для того, щоб запобігти активації гену IФНγ, і стають стійкими до дії цього цитокіну.

Взаємний антагонізм Тх1 і Тх2 дозволив пояснити багато феноменів, які в 70-ті роки пов’язували із діяльністю Т супресорів. За сучасними уявленнями, в залежності від ситуації, одні й ті самі Т клітини можуть бути активаторами або супресорами. Чинниками їх дії є цитокіни типу IЛ-4 або IФНγ.

Прикладом таких взаємодій є відповідь на інфекцію лейшманіями. Тх1 секретують IФНγ і ФНПα, які активують макрофаги. Макрофаги синтезують закис азоту (NO), який є потужним токсичним агентом для внутрішньоклітинної інфекції. Тх2 синтезують IЛ-4 та IЛ-10, які пригнічують експресію NO-синтази і сприяють розвитку лейшманіозу (наприклад, у мишей BALB/c). Таким чином, у даному випадку Тх2 виступають як супресори.

56

Таким чином, головним фактором регуляції імунної відповіді є антиген. В

залежності від способу попадання до клітин імунної системи чи клітин-мішеней (ендогенного чи екзогенного) він може бути представленим з МНС І або ІІ, що є першим визначальним моментом розвитку гуморальної чи клітинної відповіді. Характер процесингу залежить також від дози антигену: ми пам’ятаємо, що при надлишку ендогенного антигену він представляється також із МНС ІІ, а надлишок екзогенного антигену може бути представлений із МНС І.

В залежності від типу антигену, способу його попадання і дози відбувається активація тих чи інших регуляторних Т клітин, які за допомогою своїх цитокінів готують базу для гуморальної чи клітинної відповіді, що є другим визначальним моментом. Тх1 активують попередників ЦТЛ, а Тх2 – В лімфоцити. Їхні цитокіни також стимулюють появу костимуляторних молекул Т і В лімфоцитів.

Резюме.

1.Головним фактором регуляції імунної відповіді є антиген, що визначає, яким шляхом, клітинним чи гуморальним, буде розвиватися імунна реакція.

2.Головною регуляторною клітиною є CD4+ Т лімфоцит. В залежності від типу цитокінів, що продукуються, CD4+ Т лімфоцити діляться на Тх1 і Тх2. Тх1 стимулюють клітинну цитотоксичну відповідь, а Тх2 – гуморальну. Вони розвиваються у середовищі із різним вмістом цитокінів і взаємно пригнічують одне одного.

3.На клітинному рівні, регуляція означає контроль за експресією інтерлейкінів і рецепторів до них, а також костимуляторних молекул.

4.На молекулярному рівні, регуляція змінює характер передачі сигналу від поверхні клітини до ядра.

Лекція 10. Активація та механізм дії цитотоксичних Т лімфоцитів (ЦТЛ). Апоптоз.

1.Активація ЦТЛ.

Активація попередників ЦТЛ загалом нагадує таку для CD4+ Т-хелперів. У порівнянні з ними, CD8-позитивні ЦТЛ є потенційно більш деструктивними для організму і тому для своєї активації потребують більше додаткових сигналів.

ЦТЛ впізнають ендогенні антигени (серед яких віруси та внутрішньоклітинні паразити) у комплексі з МНС І; їх головним активатором є цитокін ІЛ-2. Відомі три джерела ІЛ-2 для активації попередника ЦТЛ.

1.Якщо антиген представлено клітиною, що експресує високі рівні В7.1 (наприклад, дендритною клітиною), то взаємодія В7.1 – CD28 призводить до синтезу ІЛ-2 самим попередником ЦТЛ. Одночасно починає експресуватися рецептор до ІЛ-2. В результаті, ІЛ-2 працює як аутокринний активатор і стимулює проліферацію та диференціювання попередника ЦТЛ.

2.Якщо антиген представлено макрофагом або В лімфоцитом, то одночасна активація CD4+ клітин через CD40 – CD40L призводить до підвищення експресії В7.1 і далі по типу 1.

57

3. ІЛ-2 продукується в результаті активації Тх1. ІФН-гамма, що також продукується Тх1, сприяє підвищенню рівнів експресії МНС І і ІІ і, таким чином, більш ефективному представленню антигенів.

В результаті дії ІЛ-2 попередник ЦТЛ починає ділитися і диференціюватися. Диференціювання полягає в тому, що CD8+ клітина починає експресувати поверхневий білок FasL і синтезувати спеціальні білки: перфорін, гранзими та гранулізін. FasL взаємодіє із білком Fas на поверхні клітини-мішені і є провідником апоптозу (дивись нижче). Перфорін, гранзими і гранулізін накопичуються у спеціальних гранулах і екзоцитуються при контакті ЦТЛ із клітиною-мішенню.

2. Механізм дії ЦТЛ.

Контакт ЦТЛ із клітиною-мішенню відбувається за рахунок взаємодії ряду поверхневих молекул:

-Т-рецептор/CD3 – MHC I/антиген

-CD8 – MHC I

-LFA1 – ICAM1

-CD2 – LFA3

Поверхня контакту дуже велика і щільна. В результаті проходження сигналу крізь Т-рецептор відбувається швидка переорієнтація цитоскелету, комплексу Гольджі та цитотоксичних гранул. Через 10 хвилин вони вже підходять до поверхні контакту ЦТЛ - клітина-мішень. Усі процеси лізісу відбуваються тільки у місці контакту двох клітин, тобто є цілеспрямованими. Вважають, що гранули утворюються на перехрещенні біосинтетичного та ендосомального шляхів (по аналогії з метаболізмом МНС ІІ) і є мультивезикулярними ендосомами. В процесі екзоцитозу гранули зливаються із мембраною ЦТЛ. На мембранах гранул знайдено всі компоненти взаємодії ЦТЛ із мішенню: T-рецептор, CD3, CD8 та МНС І.

Перфорін – білок з молекулярною масою 70 КДа, гомологічний С9 компоненту комплемента і діє подібним чином: взаємодіє із фосфорилхоліновими голівками мембранних фосфоліпідів, включається у ліпідний бішар і полімеризується у трансмембранну трубку. В результаті в мембрані утворюються пори діаметром 5 і 16нм.

Гранзими – протеолітичні ферменти, що потрапляють у клітину-мішень як крізь пору, пробиту перфоріном, так і через спеціальні рецептори. Вони включають у клітині-мішені механізми апоптозу.

ЦТЛ необхідні для знищення клітин, інфікованих вірусами і внутрішньоклітинними патогенами. Відомо, що деякі із них розвинулись в процесі еволюції так, щоб уникнути попадання в фагоцитарні вакуолі (Listeria monocytogenes, Trypanosoma cruzi). Деякі мікроорганізми фагоцитуються макрофагами і продовжують існувати всередині фагосом (Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Micobacterium tuberculosis). Після лізісу клітини-мішені всі вони потрапляють у міжклітинне середовище і здатні інфікувати інші клітини. Для знищення таких звільнених патогенів ЦТЛ екзоцитують спеціальні речовини, одна з яких називається гранулізін. Він присутній у гранулах як ЦТЛ, так і природних кілерів і посідає мікробіцидної активності. Гранулізін діє безпосередньо на мікроорганізм, пошкоджуючи його мембрану.

Необхідно зазначити, що ЦТЛ не є гомогенною популяцією клітин. Цитотоксичний ефект може бути досягнутий кількома шляхами і за рахунок різних типів взаємодій, що підвищує надійність імунного захисту. Так, класичні CD8+CD4- ЦТЛ знищують свої мішені переважно за допомогою

58

цитотоксичних гранул. Подвійно негативні ЦТЛ, CD8-CD4-, стимулюють в клітинах-мішенях Fas-залежний апоптоз. Існує популяція ЦТЛ, які впізнають антигени у комплексі не з МНС І, а з іншою молекулою CD1, яка зокрема ефективно представляє ліпідні антигени. І, нарешті, γδТ клітини

впізнають вільні антигени, тобто можуть знищити бактеріальні клітини як такі.

В останні роки було з’ясовано, що дихотомія, подібна CD4+ Т-хелперам, спостерігається і для CD8+ цитотоксичних Т лімфоцитів. Там теж існують субпопуляції, що відрізняються за спектром лімфокінів, необхідних для їх розвитку і діяльності. Не виключено, що частина з них може виконувати регуляторні функції.

3. Нормальні (природні) кілери.

Механізм цитотоксичної дії, притаманний ЦТЛ, використовують також інші клітини-захисники – так звані нормальні, або природні, кілери. Морфологічно природні кілери є типовими лімфоцитами, вони диференціюються в кістковому мозку та тимусі із спільного із Т лімфоцитами попередника, але не експресують генів антиген-специфічних рецепторів, тобто не впізнають антиген подібно до Т лімфоцитів. Вони мають цитолітичний аппарат, подібний до ЦТЛ, і продукують цитокіни, подібно до Тх (ІФН, ФНП). На відміну від Т лімфоцитів, природні кілери реалізують свої ефекторні функції при першому ж контакті із мішенню, тобто не потребують стадії проліферації. Вони вражають мішені як шляхом контактного лізису, так і розчинними факторами, які руйнують ДНК клітин-мішеней і внутрішньоклітинних вірусів, супресують реплікацію вірусів, посідають бактерицидної, фунгістатичної та анти-протозойної активності. Природні кілери приймають участь у знищенні інфікованих клітин, відторгненні трансплантатів і є одними з головних чинників протипухлинного захисту.

Механізм активації природних кілерів відрізняється від такого у Т лімфоцитів. Природні кілери несуть два типи рецепторів. Перший тип – це лектиноподібні білки, які впізнають олігосахариди гангліозидів і глюкозоаміногліканів клітинних мембран. Зв’язування таких рецепторів генерує активаційний сигнал в клітині. Другий тип рецепторів впізнає консервативні ділянки власних МНС; зв’язування цих рецепторів генерує інгібіторний сигнал. Активація природних кілерів відбувається при порушенні балансу активаційних і інгібіторних сигналів, тобто руйнуванню піддаються клітини, що не мають достатньої кількості власних МНС: клітини мікроорганізмів, алогенні клітини трансплантатів, пухлинні клітини, в яких знижено експресію МНС І, і навіть нормальні власні клітини, що інтенсивно діляться. Гібриди першого покоління відторгають клітини одного із батьків, оскільки на них немає антигенів гістосумісності другого генотипу. Таким чином, нормальні кілери впізнають «чуже» за відсутністю «свого». Вони є проміжним етапом між природним і надбаним імунітетом. Вони морфологічно схожі до Т лімфоцитів, мають спільні з ними етапи диференціювання, подібний ефекторний (цитолітичний) аппарат і здатні відрізняти алогенні МНС. З іншого боку, природні кілери не експресують генів, що підлягають перебудові, і, відповідно, не мають рецепторів, подібних до імуноглобулінів чи Т-клітинних рецепторів. Їхні ефекторні реакції реалізуються швидше, ніж у ЦТЛ. Клітини, подібні до природних кілерів, знаходять навіть у бесхребетних організмів, які теж можуть впізнавати «чуже» за відсутністю «свого». Це означає, що природні кілери є древніми клітинами-захисниками, яких ми

59

успадкували від далеких предків. В ході еволюції утворилися і клітини, проміжні між природними кілерами і т лімфоцитами – це так звані НК-подібні Т лімфоцити. Вони несуть на своїй поверхні як антиген-специфічний рецептор, так і активаційний рецептор природних кілерів. Таких клітин багато в кістковому мозку і печінці, вони мають обмежений репертуар Т- рецепторів, продукують гамма-ІФН і посідають цитотоксичної активності.

Таким чином, природа випробувала різні засоби знищення агентів, що відрізняються від клітин власного організму; специфічні імунні реакції є тільки невеликою надбудовою величезного масиву неспецифічного (природног) імунітету.

4. Апоптоз.

Одним із механізмів знищення клітин-мішеней в процесі цитотоксичних імунних реакцій є включення в клітині шляху запрограмованої загибелі – апоптозу. Цей шлях має надзвичайно велике значення для життєдіяльності будь-якого організму: ембріонального розвитку, диференціювання і атрофії тканин. Біологічні системи, як відомо, забезпечують свою надійність, зокрема, за рахунок виробництва перебільшених кількостей клітин, зародків і особистостей. Із них відбираються, виживають ті, що найбільш досконало виконують свою функцію. На рівні організму теж постійно ідуть процеси відбору, контролю за якістю клітин; недосконалі знищуються. Наприклад, в процесі ембріонального розвитку утворюється велика кількість нервових клітин, із яких тільки невелика частина виживає і виконує свої функції у дорослому стані, всі інші гинуть шляхом апоптозу. Тестом на проходження пунктів контролю є взаємодія рецепторів клітин із певними лігандами. Відсутність такої взаємодії призводить до включення внутрішньоклітинної програми загибелі. Таким чином, апоптоз – це доля клітини у разі відсутності сигналів виживання, інакше кажучи, – шлях дефолту (по умовчанню). Для того, щоб вижити і розвиватися, клітина повинна постійно отримувати сигнали, що проштовхують її по шляху розвитку. Сигнали виживання можуть бути різної природи: розчинними ростовими факторами, цитокінами, або результатом безпосередньої взаємодії клітин між собою чи із зовнішньоклітинним оточенням. Ці фактори необхідні на певних етапах розвитку клітин, а також можуть врятувати клітину від апоптозу, викликаного токсичними агентами.

Апоптоз спостерігається при дегенеративних захворюваннях, наприклад, хворобах Альцгеймера і Паркінсона, де він відіграє патологічну роль. Навпаки, пухлинний ріст стає можливим як раз при порушенні нормальних механізмів знищення трансформованих клітин. В імунологічних процесах апоптоз важливий для селекції репертуару імунних клітин (що буде розглянуто в окремій лекції), їх активації і дії ЦТЛ.

Термін апоптоз було вперше запропоновано в 1972 році для позначення запрограмованого руйнування клітини, яке стимулює їх фагоцитоз макрофагами. Він принципово відрізняється від іншого шляху загибелі клітин – некрозу.

Некроз – це загибель, що супроводжується порушенням зовнішньої мембрани клітини, руйнуванням її органел; відбувається під дією зовнішніх факторів (різке охолодження чи нагрів, зміна вологості, осмотичного тиску) і з звільненням енергії, тобто з підвищенням ентропії системи.

Апоптоз – це активний процес, який супроводжується активацією певних генів. В результаті органели клітини не руйнуються, мембрана зберігає свою рігідність, відбувається конденсація хроматину, утворення типових апоптичних тілець і характерна міжнуклеосомна фрагментація ДНК. Мембрана змінюється так,

60

що стимулює фагоцитоз зруйнованої клітини макрофагами. Загалом, процес потребує зовнішньої енергії, тобто іде із зменшенням ентропії.

Бум вивчення апоптозу прийшовся на 90-ті роки, коли було знайдено більше двох десятків молекул, що приймають участь в цьому процесі, і визначено загальні механізми апоптозу.

2.Механізми апоптозу (Рис. 19).

А) Рецептори смерті.

Першим рецептором апоптозу, ідентифікованим наприкінці 80-х років, був

білок Fas (CD95). Цей білок відноситься до родини білків CD40 і рецептору до TNF. Апоптоз наступає після того, як Fas зв’яже свій специфічний ліганд, який так

іназивають Fas-ліганд (FasL). Fas-ліганд відноситься до родини TNFα і СD40L. Fas

іFas-L можуть бути експресовані як на різних клітинах, взаємодія яких генерує сигнал смерті (як у випадку ЦТЛ), так і на одній і тій самій клітині: в такому разі вони взаємодіють між собою за рахунок тікучості, вигинання мембрани. Рівень експресії гену fas визначає здатність клітини до апоптозу. Так, кількість білка Fas на мембрані Т лімфоцитів збільшується при зв’язуванні антигену із Т-клітинним рецептором: таким чином клітина, що зустрілася з антигеном, підсилює контроль за своєю діяльністю для того, щоб краще загинути, ніж відповісти на антиген недосконало. І, навпаки, зв’язування поверхневих імуноглобулінів на В лімфоцитах в зародкових центрах лімфоїдних органів захищає їх від апоптозу шляхом зниження рівню білка Fas.

Пізніше було відкрито цілу родину рецепторів смерті, подібних Fas, до яких відносяться також рецептори до TNF. Всі вони посиленно експресуються під дією екстремальних умов навколишнього середовища, тобто клітина сама включає механізм запрограмованої загибелі. Сигнал смерті також передають рецептори до гранзимів.

Б) Сигнальні каскади апоптозу.

Умовою передачі сигналу загибелі є наявність в цитоплазматичній частині рецепторів певних пептидних мотивів, названих “доменами смерті”. Домени смерті, за участю специфічних кіназ і фосфатаз, запускають всередині клітини аутокаталітичний каскад, що призводить до протеолітичної модифікації багатьох субстратів. Його виконують спеціальні білки, названі каспазами (caspases, від наявності цистеїну (Cys) в активному центрі і аспарагіну (Asp) у сайті розщеплення). У ссавців відомо близько десяти таких білків. В клітині, що нормально функціонує, каспази знаходяться у неактивному стані. Поштовхом до їх активації можуть бути:

1)активація доменів смерті відповідних рецепторів;

2)зв’язування клітиною гранзиму В;

3)ендогенний фактор – мітохондріальний білок Apaf-1. При зменшенні енергопостачання клітини першими страждають мітохондрії. При цьому із них звільняється цитохром с, який зв’язує Apaf-1, і цей комплекс активує каспазу-3 – апопаїн;

4)церамід – продукт розпаду сфінгомієліну клітинних мембран. За своєю будовою він схожий на діацилгліцерол, але, на відміну від останнього, запускає сигнальний каскад загибелі, а не активації.

Таким чином, зрозуміло, що існує декілька потенційних шляхів апоптозу, що спрацьовують під дією різних ендогенних і екзогенних факторів.

В) Гени апоптозу.

Сигнальні каскади апоптозу призводять до активації певних генів. По-перше, активуються ті ж самі гени передранньої відповіді, що працюють при звичайних