1.3.1 Проницаемость мембран и протоплазмы

Способность веществ преодолевать мембранный барьер зависит прежде всего от их химической природы. Еще на заре ХХ в. английский ученый Дж. Овергон показал, что вещества, имеющие сродство к жирам (липофильные), легко проходят в клетку. Это объясняется их сродством к мембран­ному матриксу, состоящему из липидов. Гидрофильные веще­ства, в первую очередь вода, по-видимому, «протискиваются» через мембранные поры. Поэтому для их проникновения суще­ственное значение имеют размеры молекулы. Само понятие «поры» скорее всего является не структурным, а функциональным. Иными словами, пора - это не отверстие в мембране, а участок, обладающий гидрофильными свойствами и способный проводить гидрофильные вещества. В среднем размер такой поры 0,3-0,5 им. Лабильность структуры мембраны, обуслов­ленная слабыми связями между ее компонентами, приводит к тому, что поры могут менять расположение и размеры. Это объясняет изменчивость пропускной способности мембраны.

Все известные механизмы, обеспечивающие передвижение атомов, ионов или молекул между клеткой и средой, можно разделить на 2 категории: пассивный и активный транспорт.

К первой относятся процессы, про­исходящие по законам физики и химии. Направление движения молекул и ионов в этом случае определяется градиентами, существующими между клеткой и окружающей ее средой. Живая клетка не затра­чивает на транспорт веществ собственной энергии. Такой тип транспорта называется пассивным. Пассивный транспорт - это движение веществ по физико-химическим градиентам без затраты клеткой метаболической энергии - происходит как в живой, так и в неживой природе.

Одним из механизмов пассивного транспорта является диффузия. В газах и жидкостях молекулы и ионы находятся в постоянном движении благодаря кинетической энергии, которой обладают эти частицы. По второму закону термодинамики каждая система стремится уменьшить свою внут­реннюю энергию и увеличить энтропию. Поэтому в сообщаю­щихся растворах разных концентраций частицы растворенного вещества будут перемещаться из более концентрированного рас­твора в менее концентрированный. Одновременно из второго сосуда в первый на том же основании будут передвигать­ся молекулы растворителя. Процесс направленного передвижения молекул продолжится до тех пор, пока концентрация раство­ренного вещества в обеих частях системы не станет одинаковой. При этом энергия движущихся частиц в любой единице объема данной системы уравнивается - химический потенциал будет одинаков. Таким образом, движущей силой диффузии, происхо­дящей за счет тепловой энергии, является градиент концентра­ции (Dс) или градиент химического потенциала (Dm) данного вещества, который зависит от природы диффундирующего вещества (коэффициента диффузии). Это выражается уравнением Фика:где - число частиц, диффундирующих за единица времени (скорость диффу­зии). Д - коэффициент диффузии, - площадь поверхности диффузии, - ­градиент концентрации между двумя системами.

Пассивно вещества могут диффундировать:

через липидную фазу (растворимые в жирах),

по промежуткам между липидами,

с помощью липофильных переносчиков,

по специальным каналам (гидрофильные вещества)

под влиянием МП (электрофорез).

Если объемы с различными концентрациями не сообщаются, а разделены перегородкой, проницаемой для растворителя, но непроницаемой для растворенного вещества, то выравнивание концентраций будет происходить лишь за счет перемещения молекул растворителя. Такие перегородки называют полупроницае­мыми, а движение частиц через них - осмосом. Т.о., осмос - это одностороннее движение раство­рителя через полупроницаемую мембрану по градиенту концент­рации (химического потенциала). Поскольку почвенный раствор всегда сильнее разбавлен (химический потенциал воды выше), чем раствор веществ в клетке, то вода поступает в клетку по законам осмоса.

Одной из форм пассивного транспорта является электрофорез - движение заряженных частиц за счет электрической энергии по градиенту электрического потенциала. Предположим, что две системы, (содержащие раствор электролита разделены мембраной, проницаемой для ионов. Поверхность мембраны, обращенная к первой системе, заряжена отрицательно по отношению к противоположной ее стороне, которая заряжена положительно. В результате этого под действием электродвижущей силы в обеих системах возникает направленный ток заряженных частиц - из первой системы во вторую будут перемещать анионы, из второй в первую - катионы.

Известно, что на клеточных мембранах генерируется и поддерживается электрический потенциал определенной величины - мембранный потенциал (МП). Внешняя мембрана растительной клетки - плазмалемма - имеет потенциал, равный в среднем -120...-150 мВ, МП тонопласта составляет -90..-120 мВ, хлоропластов -50...-70, митохондрий -120..-170 мВ, клеточная оболочка -50...-70 мВ. Знак «минус» перед цифрой, выражающей значение МП означает, что внутреннее содержимое нормально функционирующей клекки заряжено отрицательно по отношению к внешней среде. Составляющими электрического градиента на мембране являются диффузионный потенциал (обеспечивает 30-40 % значения МП), доннановский потенциал (10...-15 %) и активность электрогенных насосов в клетке (достигается 45-50 %).

Диффузионный потенциал возникает в результате различной проницаемости ионов через мембрана и, как следствие, градиента их активности между клеткой и средой.

Доннановский потенциал образуется за счет фиксированных зарядов, присущих находящимся в клетке молекулам белков, нуклеиновых кислот, пектиновых и других веществ.

Итак, реальной движу­щей силой ионов является градиент электрохимического потен­циала, который выражается в джоулях на моль.

Другая категория процессов транспорта веществ - активный транспорт - присуща только живым организмам, которые спо­собны осуществлять передвижение молекул и ионов против физико-химических градиентов. Для этого клетке необходимо затратить часть выработанной ею энергии, запасенной чаще всего в молекулах АТФ. Энергетические затраты клетки на активный транспорт веществ очень велики - они могут достигать 40 % всей энергии дыхания.

По современным данным, диффузия воды через липидный матрикс может осуществляться также с помощью кинкизомеров. Это длинные углеводородные цепочки остатков высших карбоновых кислот в жидком матриксе мембраны, которые находятся в постоянном тепловом движении. Если вокруг какой-либо С-С-связи в прямой углеводородной цепи произойдет поворот на 120°, то соседняя с ней С-С-связь также повернется на 120°, но в противоположном направлении. При этом образуется «излом», ограничивающий небольшой пустой объем, который не остается на месте, а перемещается вдоль цепи. В этом объеме, как в пакете, через мембрану могут проходить молекулы воды и некоторые растворенные вещества.

Минеральные элементы, находящиеся в окружающей среде (почве) в растворенном состоя­нии (в виде ионов), преодолевают мембрану в виде гидратированных в различной степени частиц. Молекулы воды, как известно, являются диполями и вследствие этого ориентируются вокруг положительно или отрицательно за­ряженных ионов соответствующими полюсами. Размеры гидратируемых частиц сильно увеличиваются, что препятствует их проникновению через поры мембраны. Чем более гидратирован ион, тем труднее ему преодолеть мембрану. Степень гидратации ионов зависит от их заряда и размеров атомного ядра. Гидрата­ционное число увеличивается в ряду катионов таким образом: калий - 4, натрий - 5, кальций - 10, магний - 13, алюминий - 21.

Движение ионов через мембраны связывают со специфическими молекулами-переносчиками - ионофорами. Действие ионофоров можно представить на примере функционирования антибиотиков - веществ, вырабатываемые некоторыми грибами и бакте­риями и действующих в очень низких концентрациях (10^-11...-10-⁶ М). Антибиотик, продуцируемый бактериями Streptomices fulvissimus, - валиномицин - представляет собой циклический полипептид, почти не растворимый в воде. Сродство валиномицина к мембранному матриксу обеспечивается гидрофобными радикалами, расположенными на поверхности молекулы, в то время как на внутренней ее части имеются карбоксильные груп­пы, с атомами кислорода которых ион К⁺ образует координа­ционные связи (рис.). Благодаря неполярному «чехлу» он благополучно преодолевает мембрану. Переносчик при этом может быть уподоблен челноку, курсирующему от одной поверх­ности мембраны к другой. Внутренний размер «молекулярного мешка» обеспечивает высокую избирательность к определенному иону. Так, валиномицин связывает и транспортирует ион К⁺ в 1000 раз эффективнее, чем ион Na⁺.

Другой антибиотик - грамицидин - представляет собой ли­нейный полипептид, 2 молекулы которого образуют спирале­видный канал, в котором гидрофильные группы обращены внутрь, а гидрофобные - к мембранному матриксу. По гидро­фильному каналу происходит передвижение через мембрану ионов (рис.).

Способность антибиотиков наводить каналы ионной проводимости обусловливает их медицинское значение, так как является мощным средством ионного опустошения клеток патогенных микроорганизмов. Вследствие сильного повышения проницае­мости («продырявливания») клеточных мембран под действием антибиотиков происходит быстрая утечка K⁺ и других важных элементов из клеток возбудителей болезней, в связи с чем наступает их гибель. На этом основан терапевтический эффект анти­биотиков в борьбе с инфекционными заболеваниями.

Фитопатогенные грибы способны вырабатывать весьма специфические вещества, с помощью которых они воздействуют на поражаемые растения, увеличивая проницаемость клеточных мембран, чем причиняют растительному организму вред. Идентификация мембранных переносчиков растений и изучение их действия для ученых-биологов - важная задача, решение которой может иметь практическое зна­чение.

Активный транспорт. Известно, что основные макро- и мик­роэлементы в нормальных условиях жизнедеятельности находятся в клетке в концентрациях, значительно превышающих их содержание в окружающей среде. Так как со стороны цитоплаз­мы мембраны заряжены отрицательно, анионы не могут поступать в клетку пассивно, поскольку и концентрационный и электрохимический компоненты движущей силы направлены не в клетку, а из нее. Тем не менее клетка поглощает NO₃^-, Н₃РО₄^- и др. анионы. Следова­тельно, их транспорт в клетку представляет собой активный процесс, требующий затрат энергии.

Что касается катионов, то, хотя концентрационный градиент, как правило, направляет их движение из клетки в окружающую среду, электрическая составляющая движущей силы действует в противоположном направлении. В каждом конкретном случае направление пассивного тока катио­нов будет определяться соотношением двух сил - химической и электрической.

Для того чтобы решить, активно или пассивно движется ион и каково направление его движения - в клетку или из нее при конкретном соотношении концентраций иона в клетке и окружающей среде, используют упрощенное уравнение Нернста:

где - потенциал Нерста (МП), абсолютное значение; - ­валентность н заряд иона. с_- внутренняя концентрация иона: с - внешняя концентрация иона.

Зная величину МП, можно рассчитать каким должно быть соотношение внутренней н внешней концентрации данного иона при пассивное его перемещении за счет электрохимического градиента. Если реально найденное соотношение внутренней и внешней концентрации отличается от рас­четного, значит, клетка затрачивает метаболическую энергию на поглощение или на выделение данного иона, то есть осуществляет его активный транспорт.

На практике МП клетки измеряют с подошью электродов, представляющих собой тончайшие ка­пилляры, заполненные 3М КСl и открытые на концах. Один из капилляров погружен в окружающий раствор, а другой вводят в цитоплазму клетки с помощью микроманипулятора под микроскопом. С другой стороны эти электроды через хлорсеребряный или каломельный электрод присоединяют к высокоомному вольтметру, который и показывает величину МП. Концентрацию иона в окружающей среде измеряют стандартными методами. Для определения внутриклеточной концентрации либо получают экстракт из убитых тканей, либо при помощи центрифугирования выделяют из крупные клеток тонопласты с вакуолярным соком. В экстрактах или выделенных вакуолях концентрацию исследуемого иона измеряют обычными метода­ми.

В качестве критерия активности и пассивности ионного транспорта может быть использована его зависимость от уровня метаболизма клетки. Первые представления об активном транс­порте веществ связаны с именами американского ученого Д. Хогланда и выдающегося отечественного физиолога Л. А. Саби­нина.

Доказано, что движение ионов против электрохимического градиента стимулируется теми факторами, которые положитель­но влияют на дыхание и фотосинтез. Последние, как известно, являются источниками АТФ в живом клетке. К числу активаторов транспорта ионов относятся свет, температура, содержа­ние в среде кислорода, а в растении - углеводов (субстратов дыхания). С другой стороны, воздействие на растение дыха­тельных ядов сильно тормозит поглощение минеральных ве­ществ.

Системы, отвечаю­щие за передвижение ионов против электрохимического градиента, по-видимому, должны иметь сродство к мембранному матриксу; быть достаточно структурно ла­бильными, чтобы осущест­влять передвижение какого-либо вещества; иметь участки, ответственные за специфичес­кое присоединение какого-­либо иона (молекулы); обла­дать АТФ-азной активностью, то есть способностью гидролизовать молекулу АТФ до АДФ и неорганического фос­фата с высвобождением энер­гии макроэргической связи, которая и обеспечивает транспорт иона.

Современные исследования мембран, позволяют выявить в них крупные глобулярные образования, которые представляют собой белки, часто имеющие четвертичную структуру. АКТИВНЫЙ транспорт веществ через мембраны связывают именно с этими БЕЛКОВЫМИ МОЛЕКУЛАМИ. Так как ионы активно «накачиваются» или «выкачиваются» клеткой, механизмы активного транспорта принято называть ионными насосами, помпами. В живой клетке функционируют насосы двух типов - электронейтральные и электрогенные.

Принцип работы электронейтрального насоса заключается в том, что он переносит через мембрану 2 иона одинакового заряда в противоположных направлениях. Поэтому в результате действия такого насоса заряд на мембране не изменяется. Механизмом подобного типа является натриево-калиевый насос. Одна из схем работы этого насоса выглядит следующим образом (рис.). Белок, отвечающий за транспорт Na⁺ н K⁺, состоит из двух структурных компонентов. Первая субъединица пронизывает матрикс мембраны, образуя в ней ионный канал, по которому могут передвигаться ионы из клетки в среду и обратно. Во 2-й субъединице, находящейся на внутренней поверхности мембраны имеются участки, способные связывать Na⁺, K⁺ и АТФ.

В результате гидролиза АТФ высвобождается энергия, за счет которой происходит поворот глобулы таким образом, что она оказывается в канале, сообщающемся с окружающей средой. В этот момент переносчик теряет способность связывать какие-либо ионы. Na⁺ выходит наружу, а К⁺ поступает в клетку. Далее белок возвращается в исходное, наиболее термо­динамически выгодное состояние. В этом положении к ион­ному каналу оказывается обращенным участок глобулы, спе­цифически связывающий K⁺, поступающий из окружающее среды. Исходное конформационное состояние глобулы обеспе­чивает присоединение к ней новых молекулы АТФ и иона Na⁺ в соответствующих центрах. Начинается следующий цикл работы ионного насоса. Элект­рический заряд на мембране при этом не меняется.

Na/K АТФ-аза обнаружена в мембранах клеток многих жи­вотных организмов. Что касается растений, то все более очевидно присутствие в их мембранах подобных насосов. Профессором Д. Б. Вахмистровым достоверно показана работа Na+/K+ помпы у растений, приспособленных к жизни в условиях засоления, связана с необходимостью выкачивать избыток натрия. Возможно, Na⁺/K⁺АТФ-аза акти­вируется растительными клетками и в других крайних условиях, когда подавляется деятельность активных механизмов другого рода.

Работа электрогенного насоса заключается в том, что он переносит ион определенного заряда только в одну сторону, поэтому за счет его работы происходит генерация электричес­кого потенциала на мембране. Образующаяся таким образом электродвижущая сила обеспечивает перемещение ионов путем электрофореза. Универсальным для всех клеток механизмом подобного рода является протонная помпа (рис. 2). Встроен­ный в плазмалемму (и другие мембраны) белок, состоящий из нескольких субъединиц, осуществляет выброс протонов водо­рода за счет энергии гидролизуемой АТФ - первично активный транспорт. В результате этого на мембране генерируется электрохимический потенциал (Dm_Н+), компонентами которого являются гра­диент электрического (Dy) и концентрационного (DрН) по­тенциалов: (Dm_Н+=Dy+DрН). Электрический градиент обеспечивает движение в клетку катионов. Концентрационный градиент протонов опре­деляет их осмотический отток в клетку с помощью переносчиков. Этот обратный ток протонов может быть сопряжен с однонаправленным транспортом ионов (симпорт), противоположно направленным таком катионов (антипорт), а также совместным движением органических молекул (котранспорт). Таким образом, потоки ионов и молекул в клетке опосредованы деятельностью протонной помпы и поэтому могут считаться вторично активным транспортом (рис.!).

Протонная помпа участвует: 1) в регуляции внутриклеточного рН; 2) создании МП; запасании и трансформации энергии; 3) мембранном и дальнем транспорте вв.; 4) поглощении МВ корнями; 5) росте и двигательной активности.