Работа 40. Определение белка в семенах по биуретовой реакции

Зерно злаков и бобовых культур различается не только по содержанию белков, но и их фракционному составу. В зерне злаков преобладают проламины (спирторастворимые белки) и глютелины (щелочерастворимые белки), в зерне бобовых – глобулины (солерастворимые) и альбумины (водорастворимые). Поэтому для экстракции белков из зерна этих культур используют различные растворители (вода, растворы солей и щелочей, спирт).

Метод количественного определения белков, используемый в данной работе, основан на их способности реагировать в щелочной среде с сернокислой медью по месту пептидных связей. При этом образуются солеобразные комплексные соединения, окрашивающие раствор в сине-фиолетовый или красно-фиолетовый цвет. Реакцию дают все белки и полипептиды, начиная с тетрапептидов. Такое же окрашивание дает при взаимодействии с сернокислой медью в щелочной среде биурет, имеющий следующее строение:

Окрашенные белковые растворы центрифугируют (фильтруют), определяют их оптическую плотность, а затем по калибровочной кривой определяют в них концентрацию белка. Зная объем раствора, концентрацию белка и вес муки рассчитывают содержание белка.

Цель работы. Определить содержание белка в муке злаковых и бобовых культур.

Ход работы. Для анализа используют муку тонкого помола. Перед размолом семена, имеющие окрашенные пленки и оболочки (овес, рис, просо, люпин, бобы и др.), очищают. Муку подсушивают при температуре 80 С в течение 6…7 ч, а затем при температуре 105 С – 2…3 ч.

Взвешивают 200 мг муки и помещают ее в фарфоровую ступку. В муку из семян злаков приливают, постепенно перемешивая, 10 мл раствора 1 (4 %-ный раствор NаОН в 20 %-ном растворе этилового спирта). В муку из семян зернобобовых культур приливают такое же количество раствора 2 (5 %-ный раствор NаСl в 4 %-ном водном растворе NаОН). Муку растирают в растворах 15 мин для измельчения частиц зерна и экстракции белков.

Затем в ступку приливают еще 25 мл этого же раствора и 5 мл 3,1 %-ного раствора СuSО₄. Содержимое ступки еще 15 мин аккуратно перемешивают, переливают в стеклянные стаканы и оставляют для образования биуретового комплекса.

Через 1,5…2,0 часа окрашенные растворы центрифугируют 15 мин при 5…6 тыс. об/мин или фильтруют через стеклянный фильтр и определяют их оптическую плотность на фотоэлектроколориметре ФЭК-56М или КФК-2 (рис.6) при длине волны 540 нм в кюветах, шириной 5 или 10 мм.

Поставитиь стрелки!!!!

Рис. 6. Колориметр фотоэлектрический концентрационный КФК-2

Колориметр включают в сеть за 15 мин до начала измерений (кюветное отделение при этом должно быть открыто). Устанавливают необходимый цветной светофильтр, поворотом рукоятки ( ). Устанавливают минимальную чувствительность колориметра, для этого ручку ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ переводят в положение 1, ручку УСТАНОВКА 100 – в крайнее левое положение.

В кюветодержатель с одной стороны помещают кювету с растворителем, с другой стороны – кювету с исследуемым раствором. В световой пучок поворотом ручки ( ) вводят кювету с растворителем. Закрывают крышку кюветного отделения, ручками ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ и УСТАНОВКА 100 ГРУБО и ТОЧНО устанавливают стрелку колориметра на отсчет 100. Затем поворотом ручки ( ) в световой пучок вводят кювету с исследуемым раствором. Отсчет, соответствующий коэффициенту пропускания исследуемого раствора в процентах, снимают по шкале колориметра. Измерение проводят 3…5 раз и окончательное значение измеренной величины определяют как среднее арифметическое из полученных значений.

Затем по калибровочной кривой определяют концентрацию белковых растворов. Графики строят для каждой культуры на основании показаний оптической плотности растворов с известным содержанием сырого протеина (рассчитывается по общему азоту) или белка (рассчитывается по белковому азоту). Полученные данные записывают в табл. 49.

Т а б л и ц а 49. Результаты количественного определения белка в семенах зерновых и зернобобовых культур

Анализируемая культура	Оптическая плотность растворов	Количество белка по калибровочной кривой, мг/мл	Содержание белка, %

Содержание белка определяют по формуле:

Х = %,

где А – концентрация белка в растворе по калибровочной кривой, мг в 1 мл;

В – объем раствора белка, окрашенного биуретом, мл;

Н – масса навески муки, мг;

100 – коэффициент для пересчета содержания белка в проценты.

Вопросы:

1. Назовите пределы изменчивости содержания белка в зерне злаков и бобовых культур.

2. Что понимают под биологической питательной ценностью белков? Какие белки и белковые фракции обладают более высокой биологической питательной ценностью?

3. Объясните особености фракционного состава белков злаков и бобовых культур?

Материалы и оборудование: мука из семян злаков и зернобобовых культур, спиртовая щелочь – 4 %-ный раствор NаОН в 20 %-ном растворе этилового спирта (раствор 1), 5 %-ный раствор NаСl в 4 %-ном водном растворе NаОН (раствор 2), 3,1 %-ный раствор медного купороса (5 г СuSО₄Н₂О в 95 мл воды), ФЭК, центрифуга, ступки, пипетки, мерные цилиндры на 25 мл, пробирки.