Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
Інстр., метод. досліджень сап 2010.docx
Скачиваний:
3
Добавлен:
28.02.2016
Размер:
68.53 Кб
Скачать

3.2.3. Приготування гемолітичної системи.

Гемолітичну систему готують змішуванням в рівних об’ємах, 2,5% суміші еритроцитів барана та гемолітичної сироватки (гемолізин у подвоєному титрі).

Наприклад, при титрі гемолізину 1:1000 беруть 2:1000, тобто для приготування 100 см3 гемолізину беруть 0,2 см3 гемолізину з ампули і розводять в 99,8 см3 фізіологічного розчину. Отримані 100 см3 розчину гемолізину змішують з 100 см3 суміші еритроцитів. Гемолітичну систему поміщають на 20 хвилин у водяну баню при температурі 37–38°С для сенсибілізації еритроцитів.

3.2.4. Титрування комплементу.

Перед постановкою головного дослідження проводять титрування комплементу у бактеріолітичній системі з позитивною сапною і негативною сироватками та 1–2 сироватками з досліджуваної партії.

Позитивну, негативну сироватку та сироватку з партії розводять 1:10 фізіологічним розчином (1 см3 сироватки та 9 см3 фізіологічного розчину) та інактивують при температурі 60–62°С протягом 30 хвилин і розливають по 0,2 см3 в два ряди по десять пробірок.

Відбирають необхідну для даного об’єму досліджень кількість ампул (флаконів) з комплементом, розчиняють препарат у фізіологічному розчині, кількість якого вказана на ампулі (флаконі), зливають в одну ємність і перемішують. Таким чином отримують основний розчин комплементу, який зберігають в холодильнику протягом постановки реакції. З цього розчину готують розведення 1: 20 для титрування.

Для розведення комплементу беруть додатковий ряд пробірок, в яких готують попереднє розведення комплементу, але об’єм збільшують в 10 раз. Потім дозатором переносять по 0,2 см3 розведеного комплементу у всі пробірки кожного ряду і вносять інші інгредієнти, як вказано в таблиці 2.

Таблиця 2

Схема титрування комплементу в бактеріолітичній системі

Компоненти реакції

Ряд пробірок у штативі

Номери пробірок

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Негативна сироватка в розведенні 1:10

перший

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

другий

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

Антиген в робочому титрі

перший

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

другий

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Фізіологічний розчин

перший

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

другий

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

Комплемент у розведенні 1:20

перший

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

другий

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,2

Водяна баня 20 хв. при 37-38°С

Гемолітична система

перший

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

другий

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

Водяна баня 20 хв. при 37-38°С

Наприклад

перший

чг

чг

чг

чг

пг

пг

пг

пг

пг

пг

другий

чг

чг

чг

чг

пг

пг

пг

пг

пг

пг

Додатковий ряд пробірок для попереднього розведення комплементу

Комплемент у розведенні 1:20

 

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

Фізіологічний розчин

 

1,8

1,6

1,4

1,2

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

-

Примітка: ЧГ- частковий гемоліз; ПГ- повний гемоліз.

 

Титром комплементу в бактеріолітичній системі вважають мінімальну його кількість, яка необхідна для повного гемолізу суспензії еритроцитів в пробірках з негативною та досліджуваними сироватками з антигеном і без антигену, а також в пробірках з позитивною сироваткою без антигену протягом 20 хвилин у водяній бані при 37–38°С та затримку гемолізу в пробірках з сапною сироваткою і антигеном.

3.2.5. Приготування комплементу.

 

Кількість комплементу для головного досліду визначають за формулою:

ТхП

Х= ------,

20

 

де Х - кількість комплементу, необхідна для головного досліду;

Т - титр комплементу в бактеріологічній системі;

П - кількість пробірок в реакції;

20 - розведення комплементу (1:20).

 

Наприклад, в досліді 200 пробірок, титр комплементу (згідно табл.2) – 0,1.

 

Тобто, кількість його для проведення досліду:

 

0,1х200

----------- = 1,0 см3

20

 

Необхідна кількість розведеного комплементу для головного досліду дорівнює 40 см3 (0,2 см3х200). Тобто до 1,0 см3 основного розчину комплементу добавляють 39,0 см3 фізіологічного розчину.

3.3. Проведення головного дослідження.

Сироватки досліджують у розведенні 1:5, 1:10 з антигеном та 1:5 без антигену (визначення антикомплементарності сироватки). При масових дослідженнях допускається постановка реакції в одній пробірці з розведенням сироватки 1:10 з антигеном.

Для дослідження проб в одній пробірці дозатором беруть 0,02 см3 сироватки і 0,18 см3 фізіологічного розчину.

Для дослідження проб у трьох пробірках в першу наливають 0,1см3 досліджуваної сироватки і додають 0,4 см3 фізіологічного розчину (розведення 1:5). З першої пробірки переносять у другу 0,2 см3 і 0,1 см3 у третю, в яку потім додають 0,1 см3 фізіологічного розчину. Інактивацію сироваток проводять як зазначено у п. 3.2.4.

  

 

 

Таблиця 3

Головне дослідження

Компоненти реакції

Перше масове дослідження

Повторне дослідження

Контроль гемолітичної системи

Пробірки з досліджуваними сироватками

Контроль гемолітичної системи

Пробірки для кожної досліджуваної сироватки

1

2

3

 

Досліджувані сироватки

0,04

-

0,04,

0,04

0,02

 

Фізіологічний розчин

0,06

0,6

0,36

0,16

0,18

0,6

Інактивація сироваток

Антиген у робочому титрі

0,2

-

-

0,2

0,2

-

Комплемент у робочому титрі

0,2

-

0,2

0,2

0,2

-

Водяна баня 37 -38°С- 20 хв.

Гемолітична система

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

0,4

Водяна баня 37 -38°С – 20 хв.

 

При постановці головного дослідження одночасно ставлять такі контролі:

—      позитивна сапна і негативна сироватки в тих же розведеннях, що і досліджувані з антигеном і без антигену ;

—      антиген без сироватки (на антикомплементарність);

—      антиген без сироватки і комплемента (на гематоксичність);

—      гемолітична система з фізіологічним розчином.

Якщо досліджувані сироватки в одній пробірці ( розведення 1:10 з антигеном) дали затримку гемолізу, їх досліджують повторно у трьох пробірках.