Алгоритм лабораторной работы:

1. Изучение инструкции «Правила работы в бактериологической лаборатории».

2. Изучение правил работы с иммерсионным микроскопом.

3. Знакомство с оборудованием для проведения бактериологической работы, способа стерилизации бактериологической петли.

4. Приготовление мазков из культуры стафилококка.

5. Фиксация мазков пламенем.

6. Окрашивание мазков метиленовым синим на протяжении 3-5 минут.

7. Окрашивание мазков фуксином на протяжении 1-2 минут.

8. Микроскопия мазков с помощью иммерсионного микроскопа.

9. Микроскопия и анализ демонстрационных препаратов.

10. Зарисовывание препаратов в протокол.

11. Оформление протокола.

Методическое указание для студентов к практическому занятию 2

Тема: Палочковидные бактерии. Окраска по Граму. Ультраструктура бактериальной

клетки.

Цель: Освоения практических навыков окраски по методу Грама. Изучения струк-

туры бактериальной клетки.

Модуль 1. Морфология и физиология микроорганизмов.

Содержательный модуль 2. Морфология и структура прокариотов и парази-тических одноклеточных эукариотов.

Тема занятия 2. Палочковидные бактерии. Окраска по Граму. Ультраструктура бактериальной клетки.

Актуальность темы. По своей структуре бактерии (прокариоты) существенным образом отличаются от эукариотической клетки. Прокариоты – гаплоидные организмы, которые содержат один геном, не имеют ядра и большинства органоидов. Состоят из нуклеоида, цитоплазмы и оболочки. В цитоплазме могут находиться плазмиди – генетические структуры в виде небольших молекул ДНК, рибосомы и включения. Включения могут быть в виде волютина, гликогена, гранульози, пигментов, капель серы, кальция гидрокарбоната и используются при идентификации некоторых бактерий. Например, возбудитель дифтерии содержит на концах зерна волютина (метафосфаты), что позволяет их идентифицировать. Изучение морфологии бактерий осуществляется при микроскопии окрашенных микроскопических препаратов. Основным методом окраски бактерий есть окраска по Граму. Соответственно особенностям окраски по Граму все бактерии делятся на грамположительные и грамотрицательные. Этому признаку придают большое значение в современной таксономии.Деление на группы зависит от строения клеточной стенки. Основное вещество клеточной стенки – пептидогликан (муреин), связанный с липопротеидами, фосфолипидами, липополисахаридами. В клеточной стенке грамположительных бактерий содержание пептидогликана составляет 90%, а в грамотрицательных – 5-20%. У грамположительных бактерий есть пласт гликопептидов с тейхоевой кислотой, которая предопределяет стабильность ферментов клетки. При окраске по Граму, такое строение клеточной стенки грамположительных бактерий предопределяет стойкое соединение ее с генцианвиолетом и раствором Люголя и бактерии даже после обработки спиртом остаются сине-фиолетового цвета. Грамотрицательные бактерии обесцвечиваются спиртом и при дополнительной окраске фуксином становятся красными.

Знание морфологии палочковидных бактерийимеет большое значение, так как большинство инфекционных болезней вызываются именно палочковидными бактериями. Они делятся на собственно бактерии, бациллы и клостридии. Палочковидные бактерии различаются по размерам, форме концов клетки и взаимному расположению клеток. Длина палочковидных бактерий 1-10мкм, толщина – 0,5-2мкм. Палочки могут быть правильной (кишечная палочка и др.) и неправильной (коринебактерии и др.) формы, в том числе ветвящиеся, например актиномицеты. Наиболее мелкие палочковидные бактерии - риккетсии. Концы палочек могут быть как бы обрезанными (сибиреязвенная бацилла), закругленными (кишечная палочка), заостренными (фузобактерии) или в виде утолщения, и тогда палочка похожа на булаву (коринебактерии дифтерии).

К собственно бактериям относятся бактерии, которые не образуют спор (эшерихии, шигелли, возбудители дифтерии и др.). Бациллы и клостридии большей частью образуют споры и отличаются местоположением спор, характером концов палочек и их расположением. Так, клостридии имеют заостренные концы и напоминают веретено, а у бацилл концы палочек обрубленные. К бациллам относятся возбудители сибирской язвы, к клостридиям – возбудители столбняка, ботулизма и др.

Конкретные цели:

• Выучить ультраструктуру бактериальной клетки.

• Проанализировать отличия в строении эукариотов (простейших) и прокариотов.

• Ознакомиться со строением клеточной стенки грамположительных и грамотри-цательных бактерий.

• Уметь дифференцировать грамположительные и грамотрицательные бактерии в микропрепаратах.

• Описывать морфологические формы палочковидных бактерий.

• Анализировать морфологию палочковидных бактерий.

Уметь:

• Готовить микропрепараты из чистых культур палочковидных бактерий.

• Готовить микропрепараты из смеси бактерий.

• Красить микропрепараты по методу Грама.

• Распознавать грамположительные и грамотрицательные бактерии в смеси бактерий.

• Проводить микроскопию микропрепаратов с помощью иммерсионного микроскопа.

• Анализировать морфологию палочковидных бактерий.

Теоретические вопросы:

1. Морфология палочковидных бактерий.

2. Деление палочковидных бактерий по форме, размеру, характеру их концов и взаимному расположению.

3. Деление палочек на бактерии, бациллы и клостридии.

4. Ультраструктура бактериальной клетки.

5. Строение клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий.

6. Окраска по методу Грама (механизм метода, техника).

7. Отношения разных групп бактерий к окраске по Граму. Практическое значение.

8. Примеры грамположительных и грамотрицательных бактерий, патогенных для человека и заболеваний, вызванных ними.

Практические задачи, которые выполняются на занятии:

1. Приготовление микропрепаратов из чистых культур палочковидных бактерий и смеси бактерий.

2. Окраска микропрепаратов по Граму.

3. Микроскопия микропрепаратов из чистых культур палочковидных бактерий, их анализ и зарисовка в протокол.

4. Микроскопия демонстрационных микропрепаратов: собственно бактерии, стрепто-бацилли (окраска по Граму), эритроциты и палочки (окраска по Романовскому-Гимза).

5. Зарисовка демонстрационных микропрепаратов в протокол.

6. Оформление протокола.

Литература:

1. Пяткін К.Д., Кривошеїн Ю.С. Микробиология с вирусологией и иммунологией. – Киев: Высшая шк.., 1992. – 431 с.

2. Ворбьев А.В., Быков А.С., Пашков Э.П., Рыбакова А.М. Микробиология. – Г.: Медицина,1998. – 336с.

3. Медицинская микробиология / Под редакцией В.И.Покровского. – Г.: ГЄОТАР-МЕД, 2001. – 768с.

4. Конспект лекции.

Краткие методические указания к работе на практическом занятии.

В начале занятия проводится проверка уровня подготовки студентов к занятию.

Самостоятельная работа состоит из приготовления микропрепаратов из чистых культур палочковидных бактерий и смеси бактерий, окраски их по Граму, проведения микроскопии. Потом студенты зарисовывают микропрепараты и дают необходимые объяснения. В состав самостоятельной работы входит также микроскопия демонстрационных препаратов, и их зарисовка.

В конце занятия проводится тестовый контроль и анализ итогов результатов самостоятельной работы каждого студента.