6.5.4. Хромато-мас-спектрометрія
Хромато-мас-спектрометрія (ХМС) є одним із сучасних гібридних методів, який поєднує можливості хроматографічного і мас-спектрометричного аналізів. Мас-спектрометрія дає найкращі результати, коли проба містить одну речовину, а хроматографія стикається з великими труднощами при ідентифікації компонентів складних сумішей, передусім сумішей органічних і неорганічних сполук, однак є найефективнішим методом розділення. Поєднання можливостей мас-спектрометрії і хроматографії у рамках єдиного хромато-мас-спектрометричного методу дає змогу як детектувати, так і ідентифікувати невеликі концентрації органічних сполук у комплексних сумішах, притаманних, зокрема, різним забруднювачам навколишнього середовища.
Практична реалізація ідеї гібриду хроматографії з мас-спектрометрією вимагала конструктивного і технологічного об’єднання хроматографа і мас-спектрометра у єдину установку, а також створення єдиної системи отримання та обробки потоків інформації від різних вузлів цієї установки. Вирішення інформаційних проблем, наприклад, розшифровки даних аналізу, здійснено завдяки залученню засобів електронно-обчислювальної техніки. Як вирішувались проблеми об’єднання інструментальних засобів, розглянемо на прикладі тандему газовий хроматограф – мас-спектрометр (ГХ/МС).
Із різних задач, які виникають при створенні тандему ГХ/МС, візьмемо одну із найважливіших: естафету проби від хроматографа у мас-спектрометр.
Потік газу, який виходить із газового хроматографа, має тиск близько 10 5 Па; тиск газу, який входить у йонне джерело мас-спектрометра, не повинен перевищувати при різних методах йонізації 10 3– 10 Па. Оскільки компоненти проби у газі є незначної концентрації, просте зменшення тиску неможливе, необхідне відокремлення газу-носія. Здійснюють це за допомогою сепаратора. Газову суміш (газ-носій і проба) пропускають через пористу трубку (рис. 11), у якій газ-носій (зазвичай водень або гелій), із незначною молекулярною масою, дифундує через шпари трубки і відсмоктується насосом, а дещо важчі молекули взірця надходять у мас-спектрометр.
Тандем ГХ/МС може діяти у двох режимах. Вимірний блок МС настроюють на певне масове число, яке відповідає у шуканій сполуці йонам одного типу. У цьому випадку ідентифікують пік на хроматограмі, яка відповідає цій сполуці. Можливо здійснити ідентифікацію і декількох речовин, якщо запрограмувати дії вимірного блоку на послідовну реєстрацію декількох специфічних масових чисел.
В іншому варіанті режиму записують повний мас-спектр для кожного компонента проби і розташовують у пам’яті комп’ютера для подальшої обробки.
Можливості хромато-мас-спектрометрії ілюструє такий випадок: дослідження цим методом слідів органічних сполук у виносах із міських печей для спалювання сміття дало змогу виявити 99 різних сполук.
6.6. Конструктивно-технологічні елементи хроматографії
У кожній хроматографічній установці колоночної хроматографії головним вузлом є роздільна колонка. Основні конструктивні характеристики колонок – довжина, внутрішній діаметр, форма і матеріал.
Довжина колонки впливає на селективність і ефективність колонки, тривалість аналізу. При збільшенні довжини удвічі у стільки ж разів збільшується тривалість аналізу, а критерій розділення збільшується пропорційно кореню квадратному з довжини.
Збільшення внутрішнього діаметра підвищує продуктивність установки, проте спричинює також збільшення розмиття піків. При зменшенні діаметра зростають труднощі з заповненням колонки, проте зростає і швидкість рухомої фази.
Довжина колонок коливається у межах від 15–150 см до 10 м. Стандартна довжина – 1 м. Колонки для рідинної хроматографії зазвичай коротші, ніж для газової унаслідок підвищеного тиску. Внутрішній діаметр колонки становить декілька міліметрів і зрідка перевищує 12 мм.
Короткі колонки (до 2–3-х метрів завдовжки) роблять прямими або W і U-подібники, а довгим колонкам бажано надавати спіральну форму. В останньому випадку необхідно, щоб діаметр спіралі перевищував у 130–150 разів діаметр трубки. Спіральними не можуть бути колонки з внутрішнім діаметром 10-12 мм.
Матеріал, із якого виготовлюють колонки – товстостінне скло, пластмаса, алюміній, латунь, кварц, тефлон.
Крім конструктивних вимог, для колонки існують ще робочі – густина насипання адсорбенту, градієнт тиску, температура, об’єм проби.
Густина і рівномірність заповнення колонки передусім важливі для високошвидкісної рідинно-адсорбційної хроматографії і вимагають, щоб зерна адсорбенту мали сферичну форму та однаковий діаметр (10–20 км). Щільніше заповнення, яке спостерігаємо у цьому випадку, зумовлює краще змішування рухомої фази і проби по перетину колонки, створює умови для збереження постійною швидкості потоку рідини.
Для щільного заповнення колонки адсорбентом застосовують вібраційні пристрої. Можливе також м’яке утрамбування скляною паличкою. Спіральні колонки заповнюють, зазвичай, у стані прямих трубок, а згодом надають їм форму спіралі.
Від густини заповнення і розмірів частинок адсорбенту залежить об’єм проби. При зменшенні розмірів частинок і збільшенні густини упакування об’єм збільшується і становить 0,05–50 мкг.
Лінійна швидкість потоку коливається від 1 до 10 см/с. Менша швидкість – більша роздільна здатність, однак і більша тривалість аналізу.
Градієнт тиску у колонці (передусім важливий робочий параметр у РАХ) залежить від в’язкості рухомої фази, довжини колонки, швидкості потоку, діаметра частинок. При щільній упаковці і досить малих зернах перепад тиску становить (3,5 – 35) 10 6 Па (35-350 атм).
У газовій хроматографії важливо підтримувати постійну температуру протягом усього аналізу. З цією метою колонки термостатують. Коливання температури не повинно перевищувати 0,5 град. У рідинній хроматографії чинник температури не настільки важливий, як у газовій, отож аналіз проводять за кімнатної температури. Підвищують температуру лише з метою прискорення аналізу, покращання розчинності речовин.
При розділенні сполук однієї групи, які суттєво різняться за своєю леткістю (варіант газової хроматографії), низькокиплячі компоненти швидко елююють і їхні піки на хроматограмі розташовуються поруч один з одним, а менш леткі речовини вимагають більшого часу елюювання і їхні піки будуть, відповідно, ширшими і нижчими. Якщо збільшувати температуру колонки з постійною швидкістю, то можливо досягти рівномірнішого розподілу піків як за шириною, так і за розташуванням. Отриманий ефект спричинений залежністю коефіцієнтів розподілу сполук від температури. Отже, при газовій хроматографії, крім обов’язкового термостатування, використовують пристрої, які дають змогу програмувати температуру колонки.
Для введення проби у колонку існує спеціальний пристрій – дозатор. Основні вимоги до дозатора: забезпечення відтворюваності величини проби, відсутність у його внутрішньої поверхні адсорбційної активності до компонентів проби, простота і зручність під час експлуатації.
Уведення газових проб здійснюється звичайними медичними шприцами і кранами-дозаторами або за допомогою ампули з пробою. В останньому випадку ампулу після введення у носій руйнують спеціальним пристроєм з гвинтом, який роздавлює ампулу.
Тверду пробу вводять спеціальною мікропіпеткою в ампулі зі сплаву з температурою t плавлення 60,5C або за допомогою складніших спеціальних пристроїв. Дозатор обов’язково оснащують підігрівом, щоб проба могла розплавитися.
Рідинні проби вводять мікрошприцом (рис. 12) або за допомогою спеціальних кранів. Зазначимо, що у рідинній хроматографії введення проби здійснюють без зупинки потоку елюенту і зменшення тиску, отож використання шприца або крана вимагає від останніх здатності функціонувати в умовах високих тисків.
Між рідинною і газовою хроматографією існують певні відмінності в апаратурі, за допомогою якої подають рухому фазу. У ГХ подача газу-носія відбувається унаслідок підключення до балонів з газом під тиском. Гази-носії (водень, повітря, азот тощо) беруть з балонів, використовуючи редуктори, які здійснюють зниження тиску від його рівня у балоні до рівня, необхідного у хроматографічній установці.
У рідинній хроматографії для безперервної подачі під тиском рухомої фази – розчинника – необхідні пристрої, які створюють тиск у хроматографічній установці. Це поршневі помпи, помпи у вигляді великого шприца і пристрої безпоршневої подачі шляхом тиску газом. В останньому випадку рідина перебуває у резервуарі із полімерного матеріалу, розташованому у металевому посуді. У цей посуд під тиском подають газ, який витискує рідину із резервуара у колонку.
Вузол хроматографа, який вимірює і реєструє результати аналізу, складається із трьох елементів – детектора, підсилювача і реєстратора. Детектор безперервно реагує на ту чи іншу характеристику складу продукту, який виходить із колонки (наприклад, концентрацію) і виробляє електричний сигнал. Детектор здійснює перетворення зміни характеристики продукту на зміну електричного сигналу, використовуючи залежність між цією характеристикою та електричними властивостями речовини. Наприклад, зміна концентрації газу спричинює зміну його теплопровідності, яка, відповідно, впливає на зміну електричного опору провідника, розташованого у газі.
Залежно від типу детектора існує різна інтенсивність і форма сигналу. Наприклад, інтегральні детектори формують хроматограми у формі східчастої кривої, а диференціальні – кривої з піками.
У рідинній хроматографії детектування ускладнене тим, що за фізичними властивостями рухомі фази дещо відрізняються від досліджуваних розчинів. Треба вибирати детектори, принцип дії яких ґрунтується на вимірах такої властивості проби, яка не притаманна рухомій фазі.
Головними характеристиками детекторів усіх типів є: чутливість, порогова (гранична) чутливість, інерційність, діапазон лінійного зв’язку між досліджуваною характеристикою та електричним сигналом.
Чутливість є відношенням вихідного сигналу Rc до вимірюваної величини (концентрації, потоку речовини) :
. (4)
Гранична чутливість – це концентрація (потік або кількість речовини), яка спричинює сигнал Rc, рівний подвоєній величині шумів Rш (різниця між крайніми положеннями нульової лінії на хроматограмі), тобто:
.
Гранична чутливість визначається найменшим сигналом R0 = 2Rш, який фіксує детектор. Цей сигнал відповідає мінімальній концентрації.
Інерційність характеризується часом, необхідним на доставлення речовини із об’єму до чутливого елементу детектора. Інерційність впливає на форму і висоту хроматографічних піків. Бажано, щоб вона прямувала до нуля.
Лінійний діапазон є відношенням найбільшої концентрації, за якої зберігається лінійний зв’язок між і Rc, до найменшої.
Типові вузли хроматографічної установки дають змогу скомпонувати колоночні хроматографи для різних видів хроматографії різної складності: прості, універсальні, дослідницькі, промислові (автоматичні – для підтримки технологічного процесу, і препаративні – для отримання чистих речовин).
У тонкошаровій хроматографії для отримання надійних і відтворюваних результатів чимале значення має техніка експерименту. Прилади і пристрої застосовують передусім для нанесення тонкого шару сорбенту певної товщини. Це так звані аплікатори. Один з найпоширеніших аплікаторів – прилад Шталя, який дає змогу регулювати товщину шару від 0 до 2 мм на пластинках 20 20 і 20 5 см. Він складається з шаблона з пластинками, гільзи з масою сорбенту, який рухається по шаблону і покриває пластинки.
У серійний комплект обладнання для ТШХ (КТХ-01) входить аплікатор, який дає змогу регулювати товщину шару у межах 0,05 мм на пластинках 10 10, 10 20 і 20 20 см.
Сучасна апаратура для хроматографічного аналізу обладнана мікрокомп’ютерною технікою, яка дає змогу, користуючись клавіатурою, ввести у хроматограф програму аналізу, стежити за ходом аналізу за допомогою дисплея, отримувати завдяки друкуючому пристрою хроматограму, дані про час утримання і площу кожного піка тощо. Прикладом такої апаратури є рідинний хроматограф “Милихром 4”, загальний вигляд якого подано на рис. 13.
Цей хроматограф є аналітичним комплексом функціонально об’єднаних засобів вимірів і допоміжних пристроїв, що забезпечують розділення досліджуваної суміші на компоненти. Комплекс дає змогу здійснювати якісний і кількісний аналіз компонентів методом високоефективної рідинної хроматографії. Хроматограф широко застосовують в органічній і біоорганічній хімії, при проведенні фізико-хімічних досліджень у криміналістиці, медицині, при контролі навколишнього середовища.
Хроматограф “Милихром 4” складається з:
блоку управління мікропроцесорного (БУМ);
спектрофотометричного детектора на видиму область (СФД-В);
спектрофотометричного детектора на УФ-область (СФД-УФ);
пристрою введення проби автоматичного (ПВПА);
монітора;
клавіатури;
помпи;
реєстратора інформації.
Принцип дії СФД полягає у почерговому проходженні світлового пучка, монохроматизованого дифракційною ґраткою і керованого модулятором, через робочу і порівнювальну кювети з подальшою реєстрацією цього потоку фотоелектронним помножувачем.
Пристрій вводу проби автоматичний (ПВПА) забезпечує набір і подачу елюенту і проби у колонку за допомогою помпи за заздалегідь заданою програмою, що вводиться з клавіатури та індексується на моніторі.
БУМ, клавіатура і монітор слугують для задання всіх режимів і параметрів роботи СФД, рідинної системи і помпи. БУМ разом з СФД забезпечує вимір оптичної густини речовин, обробку хроматорафічної інформації, видачу результатів вимірів і обробки на реєстратор, зв’язок з зовнішньою ЕОМ.