2.2.3. Молекулярно-адсорбционная хроматография

Основана на избирательной адсорбции веществ тем или иным твердым адсорбентом, в качестве которых используются порошкообразные оксид алюминия, оксид титана, силикагель, крахмал, цеолиты, активированный уголь и т.д. Наиболее распространены колоночный и тонкослойный варианты адсорбционной хроматографии.

При колоночной хроматографии в хроматографическую колонку, представляющую собой стеклянную трубку заполненную адсорбентом, вносят раствор анализируемой смеси веществ при прохождении которой через слой адсорбента происходит распределение компонентов смеси по силе адсорбции. С помощью подаваемой в систему подвижной фазы (растворителя) адсорбированные вещества в процессе десорбции перемещаются по колонке в виде узких зон, вымываясь в порядке возрастания адсорбционной способности: вначале более слабо, затем более прочно сорбируемые молекулы. В результате из колонки в определенной последовательности выходят фракции (элюаты) разделяемых веществ. Типичный пример адсорбционной хроматографии – разделение хлорофилла М.С. Цветом на СаСО₃ (рис. 2.20).

Тонкослойная хроматография сочетает в себе признаки адсорбционной и распределительной. Метод отличается простотой исполнения, благодаря чему во многих областях вытеснил распределительную и ряд методов колоночной хроматографии. Продолжительность разделения веществ составляет минуты и тонкослойная хроматография часто используется как экспресс-метод, отличающийся хорошей избирательностью и чувствительностью.

Принцип тонкослойной хроматографии состоит в том, что на твердую основу – стеклянную или металлическую пластинку (5х20, 10х20, 20х20 см) – наносят тонкий слой подходящего порошкообразного адсорбента (2-3 мм), а на линию старта пластинки с адсорбентом – исследуемые образцы и «свидетели» (рис. 2.22). Пластинку под наклоном помещают в чашку с растворителем таким образом, чтобы нижний ее конец, вблизи которого находится линия старта, был погружен в жидкость. При передвижении подвижной фазы, под действием капиллярных сил сцепления, компоненты исследуемого образца перемещаются по слою адсорбента на разные расстояния. В момент, когда фронт жидкости подойдет к верхнему краю пластинки, разделившиеся бесцветные пятна веществ фиксируют, прокрашивают химическими реагентами, либо обнаруживают по радиоактивности или свечению в ультрафиолетовом свете.

При хроматографировании в стандартных условиях скорость перемещения компонентов – величина постоянная и служит основной характеристикой каждого конкретного соединения. Ее оценивают значением Rf, которое представляет собой отношение расстояния l, пройденного веществом, к расстоянию L, пройденному растворителем - (рис. 2.22).

Методом тонкослойной хроматографии разделяют смеси аминокислот, антибиотики тетрациклинового ряда, стероидные гормоны, пенициллины близкой структуры, алкалоиды, схожие по строению моно- и олигосахариды.

2.2.4. Проникающая (гель-) хроматография

Принцип метода состоит в неодинаковой скорости фильтрации веществ, отличающихся формой и размерами, при их прохождении через колонки с гелем. Гелем служат гидрофильные гранулы, получаемые связыванием длинных полисахаридных нитей декстрана, полиакриламида или других линейных полимеров поперечными мостиками из глицерина или эпихлоргидрина (рис. 2.23). Образующаяся трехмерная структура содержит различное количество пор разного диаметра, размер которых определяется частотой поперечных сшивок. «Сшитые» полимерные тяжи затем разрезают, просеивают сквозь сита, получая строго фиксированные по параметрам гранулы. Сетчатое трехмерное строение геля способствует набуханию его в воде. Набухшие гранулы, как правило, имеют сферическую форму, облегчая фильтрацию молекул между ими, и характеризуются наличием пор неодинакового размера. Распределение пор по размерам или по микрообъемам является определяющим свойством геля. Оно зависит от природы высокомолекулярных соединений, температуры и природы растворителя.

При нанесении смеси веществ на колонку с гелем (рис. 2.24) небольшие молекулы смеси диффундируют во внутренние поры набухшего в растворителе геля, а крупные молекулы – проходят в пространстве между частицами. При дальнейшем подключении растворителя к колонке, разделяющего анализируемые вещества, в межгелевом пространстве быстрее будут перемещаться крупные молекулы, затем по внутренним порам мелкие, отставая в скорости движения, согласно их молекулярным массам и размерам. Находящиеся в растворителе маленькие частицы (например, неорганические соли) выходят из колонки последними. Происходит как бы просеивание молекул веществ через гель.

Аппаратурная простота метода и мягкие условия разделения способствовали тому, что проникающая хроматография нашла широкое применение в биохимических исследованиях. Основное ее назначение – разделение высокомолекулярных веществ. С ее помощью выделены и очищены многие ферменты, пептидные гормоны, нуклеиновые кислоты.