Тема 4 Клеточные включения. Нуклеиновые кислоты. Ферменты.

Цель: Ознакомить с клеточными включениями, нуклеиновыми кислотами и ферментами

План: 1 Расмотреть под микроскопомпрепарат печени хвостатых амфибий

2 Расмотреть и зарисовать клеточные включения, клеточные границы, клеточные ядра

Методические рекомендации по подготовке к занятию

Чтобы сохранить жир на срезах, полученных от залитых в целлоидин или парафин объектов, необходимо применить фиксатор, в состав которого входит осмиевая кислота, фикси­рующая жир и переводящая его в нерастворимое для после­дующих реактивов состояние; в то же время она окрашивает жир в черный цвет. После осмиевых фиксаторов обычная окраска ядер гематоксилином не удается, поэтому в качестве ядерного красителя применен сафранин, окрашивающий ядра в красный цвет.

Снова под микроскопом знакомый объект — печень хвостатых амфибий, но на этот раз препарат обработан специальным образом для сохранения жировых включений в печеночных клетках. Рассматривая препарат при сла­бом увеличении, легко заметить в печеночных клетках черные шарики, представляющие собой окрашенные ос­мием липидные включения.

Нужно выбрать место, где включения видны вполне отчет­ливо, хорошо заметны клеточные границы и окрасились кле­точные ядра; рассмотреть и зарисовать препарат следует при сильном увеличении.

Клеточные границы при примененной здесь фик­сации не так заметны, как на препаратах или но все же видны достаточно ясно.

Ядра печеночных клеток — гепатоцитов как обычно, круглые, окрашены сафранином в красный цвет и, как это типично для осмированных препаратов, имеют более гомо­генный вид, чем при других фиксациях; только местами в них заметны крупные хроматиновые глыбки.

Цитоплазма гепатоцитов окрашена в бледный желто­вато-зеленый цвет. В цитоплазме видны липидные вклю­чения в виде шариков различной величины, разбро­санных по всей клетке и окрашенных в темный (от бурого до черного) цвет. Между печеночными клетками видны пигментные клетки.

Рибонуклеиновая кислота (РНК) в клетках печени лягушки

Фиксация смесью Карнуа; окраска: метиловый зеленый и пиронин

Здесь перед нами тот же объект, как и на препарате , но при другой фиксации и окраске, которые позволяют выделить как структуры, содержащие ДНК, так и части клеток, содержащие РНК- Элементы, содержащие ДНК, окрашиваются в синевато-зеленый цвет метиловым зеленым, а части клетки, содержащие РНК, окрашиваются в красный цвет пиронином. Изучить и зарисовать препарат следует при сильном увеличении.

Цитоплазма окрашена в красный цвет; ее неравно­мерная окраска указывает, что РНК больше в различных зернистых образованиях цитоплазмы. В круглых ядрах выделяются синевато-зеленые глыбки хроматина и хорошо заметно ядрышко, окрашенное в красный цвет. Эта окраска показывает, что РНК имеется не только в цитоплазме, но и в ядрышках. Проверкой заключения в местонахожде­нии РНК в клетке служит метод Браше; срезы до окраски подвергают действию рибонуклеазы— фермента, разрущающего РНК. Если способные окрашиваться в красный цвет части клетки перестают окрашиваться после действия рибонуклеазы, это служит подтверждением наличия в та­ких структурах РНК.

Ферменты

Щелочная фосфатаза в клетках канальцев первичной почки плода свиньи

Кальций-кобальтовый метод Гомори

Гистохимическое исследование ферментов основано на использовании в реакции субстрата, иначе говоря, инкуба­ционной среды. Инкубация вызывает расщепление субст­рата и выпадение осадка, который дополнительными хими­ческими реакциями переводится в окрашенное соединение, видимое под микроскопом.

Интенсивность окраски и ее распространение дают возможность судить об активности и топографии фермента в клетках и тканях.

Литература: 6, с.28-29;

Контрольные вопросы:

1 Какой краситель используется в качестве ядерного красителя?

2 Фиксация смесью Карнуа?

3 Для чего используют метод Браше?