Дата____________
Тема № 2 Физиология микроорганизмов
ЗАНЯТИЕ № 4
ФИЗИОЛОГИЯ МИКРОБОВ. ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР АЭРОБОВ И ИХ ИДЕНТИФИКАЦИЯ
Цель занятий: изучить культуральные и биохимические свойства бактерий; основные биологические свойства аэробов, методы выявления чистых культур аэробов с целью их идентификации.
СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ:
Особенности метаболизма бактерий.
Рост и размножение бактерий. Фазы размножения.
Питание бактерий.
Основные принципы культивирования.
Ферменты бактерий. Идентификация бактерий по ферментативной активности.
Внутривидовая идентификация бактерий (эпидемическое маркирование).
СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ:
Описать культуральные свойства
Идентифицировать микроорганизмы
СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ИМЕТЬ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ:
об алгоритмах и правилах их использования для идентификации микроорганизмов
Работа № 1. Методы выделения и идентификации аэробных бактерий
Цель: изучить основные методы выделения и идентификации аэробов (см. теоретическую справку)
I
II
III
А
)
*
IV
III
Ж)
Б)
Г)
Е)
В) Д)
Реакция агглютинации
I. Сбор исследуемого материала
II. Посев исследуемых микроорганизмов на простые, ДДС и элективные питательные
среды с целью получения изолированных колоний
III. Накопление чистой культуры на скошенной питательной среде
IV. Идентификация выделенной чистой культуры
А) изучение морфологических и тинкториальных свойств
Б) изучение культуральных свойств
В) изучение антигенной структуры возбудителя с помощью постановки реакции агглютинации на стекле с поливалентными и монорецепторными сыворотками
Г) изучение биохимических свойств возбудителя по результатам посева на среды Гисса
Д) определение чувствительности микробов к антибиотикам, с помощью метода бумажных дисков
Е) проба с бактериофагами (реакция фаголизабельности) – метод стекающей капли по Отто для выявления вида возбудителя
Ж) биопроба на лабораторных животных – изучают клинику и патогенез заболевания
* проведение внутривидовой идентификации для выявления источников инфекции (фаготипирование)
Работа № 2. Питательные среды
Цель: создать представление о питательных средах; классифицировать предложенные питательные среды; результаты оформить в виде таблицы (см. теоретическую справку)
|
с |
происхождение |
консистенция |
назначение | |||||
|
|
естест-венное |
искусст-венное |
жидкая |
полужидкая |
плотная |
общего |
ДДС |
элективные |
|
Мясопептон ный агар (МПА) |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Мясопептон ный бульон (МПБ) |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Среда Эндо |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Кровяной агар |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Пептонная вода |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Среды Гисса |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Среда 199 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Свернутая сыворотка |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Желточно- солевой агар (ЖСА) |
|
|
|
|
|
|
|
|
реда
В
ывод:
Работа № 3. Характер роста бактерий на питательных средах
(культуральные свойства)
Цель: изучить характер роста бактерий на основных и дифференциально-диагностических питательных средах; изучить культуральные свойства микроорганизмов на плотных средах.
|
критерии |
описание |
колонии |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Вывод:____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Работа № 4. Характер роста микроорганизмов на жидких питательных средах (дифференциально – диагностические признаки)
Цель: изучить характер роста бактерий на жидких питательных средах; изучить особенности роста микроорганизмов
Характер роста: 1) диффузный; 2) придонный; 3) поверхностный.
Опыт №1 Опыт №2 Опыт №3
МПБ МПБ 1% пептонная вода
(кишечная палочка) (возбудитель сибирской язвы) (возбудитель холеры)
Вывод:_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Работа № 5. Техника посева на жидкие и плотные питательные среды
Цель: ознакомиться с техникой посева на жидкие и плотные питательные среды и указать значение метода (см. теоретическую справку)
|
название |
рисунок |
значение |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Вывод:____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Работа № 6. Биохимическая активность аэробов (дифференциально-диагностические признаки)
Цель: изучить ферментативную активность микроорганизмов (см. теоретическую справку)
|
вид м/о
|
Сахаролитическая активность
|
Протеолитическая активность | |||||
|
лактоза |
глюкоза |
мальтоза |
маннит |
сахароза |
индол |
Н2S | |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Б) Каталазная активность аэробов
Цель: изучить каталазную активность микроорганизмов; определить тип дыхания исследуемой культуры (см. теоретическую справку)
Результат:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Вывод:_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Теоретическая справка
Работа № 1
Основные принципы выделения и идентификации чистых культур бактерий
Чистую культуру бактерий получают для проведения дифференциально-диагностических исследований - идентификации, которая достигается путем определения морфологических, культуральных, биохимических и других признаков микроорганизмов.
Морфологические и тинкториальные признаки бактерий изучают при микроскопическом исследовании мазков, окрашенных разными методами и нативных препаратов.
Культуральные свойства характеризуются питательными потребностями, условиями и типом роста бактерий на плотных и жидких питательных средах. Они устанавливаются по характеру роста на питательной среде.
При идентификации бактерий до рода и вида обращают внимание на пигменты, окрашивающие колонии и питательную среду в разнообразные цвета. Например, красный пигмент образуют Serratia marcescens, золотистый пигмент -Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк), сине-зеленый пигмент - Pseudomas aeruginosa (синегнойная палочка).
Работа № 2
Питательные среды (состав некоторых питательных сред)
Кровяной агар (для выявления микроорганизмов, вызывающих гемолиз). К расплавленному и охлажденному до 45°С МПА (2% агара) стерильно добавляют 5-10% дефибринированной стерильно взятой крови лошади, кролика или барана.
Пептонная вода. Основной раствор пептона: пептона - 100 г, хлорида натрия -50 г, нитрата калия - 1 г, карбоната натрия - 25 г, воды дистиллированной - 1 л; рН 9,0. Стерилизуют при 120°С 20 мин. Для получения пептонной воды основной раствор разводят водой в 10 раз, доводят рН до 8,8 -8,9, стерилизуют. Используют для культивирования холерных вибрионов.
Свернутая сыворотка. Кровь берут от крупных животных. В продаже имеется стерильная нормальная сыворотка крови животных для бактериологических питательных сред, расфасованная по 250 мл. Можно пользоваться человеческой сывороткой (отходами производства гамма-глобулина), остатками крови при постановке реакции Вассермана и других серологических реакций.
Среды Гисса с углеводами. Пептон - 10 г, хлорид натрия - 5 г, углевод - 10 г, реактив Андреде - 10 мл, вода дистиллированная до 1000 мл, рН после стерилизации 7,2-7,4. Дифференциально-диагностическая среда, на которой выявляют разложение углеводов микроорганизмами.
Мясопептонный агар (МПА). К готовому МПБ добавляют 2% агар и оставляют для набухания 30 мин. Кипятят до полного растворения агара. Стерилизуют 30 мин при 120°С. Применяют для выращивания большинства сапрофитных бактерий.
Среда 199. Синтетическая среда, содержащая аминокислоты, витамины, глюкозу, минеральные соли. Для выращивания клеток (как ростовую) среду используют с добавлением 5-10% коровьей или лошадиной сыворотки. Трипсин используется при получении культуры клеток для дезагрегации тканей, т.е. для разобщения клеток.
Среда Эндо (готовят непосредственно перед употреблением). К 100 мл МПА (рН 7,6) при температуре 70 °С стерильно добавляют 5 мл 20% раствора лактозы и смесь 0,5 мл насыщенного раствора основного фуксина с 1,25 мл свежеприготовленного раствора сульфата натрия. Дифференциально-диагностическая среда для культивирования бактерий кишечной группы.
Среда Плоскирева (бактоагар Ж) выпускается в сухом виде и содержит питательный агар с лактозой, бриллиантовым зеленым, солями желчных кислот, минеральными солями и индикатором (нейтральный красный). Эта среда является не только дифференциально-диагностической, но и селективной, так как подавляет рост микроорганизмов (кишечная палочка и др.) и способствует лучшему росту некоторых патогенных бактерий (возбудители брюшного тифа, паратифов, дизентерии). Лактозоотрицательные образуют на этой среде бесцветные колонии, лактозоположительные - красные.
Среда Левенштейна-Йенсена. Для приготовления этой среды в 600 мл дистиллированной воды, содержащей 12 мл глицерина, растворяют: аспарагина 3,6 г, фосфата калия однозамещенного 2,4 г, сульфата магния 0,24 г, цитрата магния 0,6 г, картофельной муки 5 г, малахитового зеленого 0,4 г. Полученную смесь стерилизуют 15 мин при 120 °С. Приготовляют 1000 мл однородной суспензии из свежих яиц. Добавляют стерильно в яичную взвесь основной солевой раствор, подогретый до 45-60°С, тщательно перемешивают, избегая появления пузырьков воздуха, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в пробирки и оставляют для свертывания в наклонном положении при 85°С 45 мин.
Желточно - солевой агар (ЖСА) содержит повышенные концентрации хлорида натрия (8-10%), которые не препятствуют размножению стафилококков, что обеспечивает элективность среды. Среда позволяет дифференцировать стафилококки, продуцирующие лецитиназу, от стафилококков, не выделяющих данный фермент, по образованию зон помутнения с перламутровым оттенком вокруг колоний лецитиназоположительных видов. Готовят среду из питательного солевого агара. В расплавленный и остуженный до 45 0С агар добавляется куриный желток.
Питание микробов
Органов питания нет. Питательные вещества поступают через всю поверхность клетки. Для питания нужны: кислород, азот, углерод, водород. Кислород и водород микробы берут из воздуха и воды. По источникам азота и углерода микробы делятся на:
- аутотрофы,
- гетеротрофы.
Аутотрофы – (литотрофы) – “auto” - своя, сам, “trophika”– питание (“самопитающиеся”). Это микробы, которые усваивают азот и углерод из воздуха или неорганических веществ. Они имеют много ферментов, поэтому способны сами синтезировать органические вещества из неорганических, для этого они используют солнечную энергию - фотосинтетики и химические вещества – хемосинтетики. Это сапрофитные микроорганизмы.
Гетеротрофы – “getero” – другой, “trophika”– питание. Это микробы, которые азот и углерод берут из органических веществ. Они делятся на 2 группы:
– используют органические соединения мертвого субстрата (сапрофиты);
– используют органические соединения организма-хозяина (паразиты).
Культивирование микробов в лабораторных условиях
Для культивирования бактерий применяют питательные среды. Они могут быть естественными (молоко, морковь, картофель), искусственными (готовят специально). Питательные среды могут быть жидкие и плотные. В зависимости от свойств микробов используют разные среды. Их делят на 4 группы:
1) простые (универсальные) - на них растут только нетребовательные микробы (стафилококки, кишечная палочка). Это МПА И МПБ - мясопептонный агар и бульон.
2) сложные (специальные) - на них растут требовательные микробы (стрептококки, пневмококки). Они готовятся из простых сред путем их обогащения:
- сахарный агар,
- кровяной агар
3) элективные (избирательные) - на них растет только один вид микробов, а другие – нет. Например: 1% щелочная пептонная вода - для холерного вибриона, сахарный агар - для стрептококка, сывороточный агар - для дифтерийной палочки и т.д.
4) дифференциально-диагностические - для отличия одного вида от другого по ферментативной активности (среда Эндо, Гисса).
Требования к питательным средам:
- питательность,
- изотоничность,
- слабощелочная реакция среды (рН 7.2 – 7.4),
- влажность,
- стерильность,
- буферность,
- унифицированность
Работа № 4