- •Методические разработки к практическим занятиям для студентов лечебно-профилактического факультета
- •Занятие 1
- •Устройство бактериологической лаборатории
- •Правила работы в бактериологической лаборатории
- •Классификация микроорганизмов
- •Принципы классификации микроорганизмов
- •5. Чувствительность к бактериофагам.
- •7. Генетическое родство с другими бактериями.
- •Морфология бактерий
- •Методы определения вида микробов
- •Бактериоскопический метод исследования
- •Техника микроскопирования с иммерсионной системой
- •Занятие 2
- •Простые и сложные методы окраски микробов
- •Структура бактериальной клетки
- •Методы выявления капсул, жгутиков, спор
- •Изучение микробов в живом состоянии
- •Занятие 3
- •Действие физических и химических факторов на микроорганизмы
- •Стерилизация. Дезинфекция
- •Основные группы дезинфицирующих и антисептических веществ, механизм их антибактериального действия
- •Физиология бактерий
- •Питание бактерий
- •Питательные среды, их классификация
- •Бактериологический метод исследования
- •Первый этап. Техника посева материала на питательные среды
- •Занятие 4
- •Характер роста микробов на питательных средах
- •1. Рост бактерий с равномерным помутнением среды.
- •Пигментообразование у бактерий
- •Выделение чистой культуры бактерий
- •Занятие 5
- •Ферменты бактерий
- •Методы определения ферментативной активности микробов
- •Энергетический метаболизм
- •Методы культивирования и выделения чистой культуры анаэробов
- •Методы выделения чистых культур облигатных анаэробов
- •Занятие 6
- •Структура вирусов
- •Бактериофаги
- •Взаимодействие с бактериальной клеткой
- •Изменчивость микроорганизмов
- •Занятие 7
- •Микробиологические основы химиотерапии инфекционных заболеваний
- •Сульфаниламиды. Антибиотики
- •Механизм действия сульфаниламидов и антибиотиков
- •Побочное действие антибактериальных препаратов на организм
- •Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам
- •Занятие 8
- •Распространение микробов в природе
- •Микрофлора почвы
- •Микрофлора воды
- •Вода как фактор передачи инфекционных заболеваний человека
- •Микрофлора воздуха
- •Воздух как фактор передачи инфекционных заболеваний человека
- •Санитарная микробиология
- •Основные характеристики санитарно-показательных микроорганизмов
- •Оценка санитарного состояния почвы по основным микробиологическим показателям
- •Занятие 9
- •Микрофлора организма человека
- •Состав нормальной микрофлоры тела человека
- •Нарушение состава нормальной микрофлоры
- •Занятие 10
- •Вопросы к тестовому компьютерному контролю по I разделу (Морфология, физиология, генетика микроорганизмов. Дезинфекция, стерилизация. Антибиотики).
- •Занятие 11
- •Занятие 12
- •Тестовые задания Тема: Неспецифическая резистентность организма
- •Занятие 13
- •Занятие 14
- •Занятие 15
- •Занятие 16
Простые и сложные методы окраски микробов
Бактериоскопический метод исследования предусматривает изучение микроорганизмов в живом или фиксированном и окрашенном состоянии. Для изучения микроорганизмов в живом состоянии используют метод раздавленной капли и метод висячей капли.
Наиболее часто применяют микроскопию бактерий в фиксированном и окрашенном состоянии. Для приготовления фиксированного и окрашенного препарата на обезжиренное предметное стекло наносят каплю воды или изотонического раствора хлорида натрия, в которую петлей вносят исследуемый материал и распределяют его таким образом, чтобы получить тонкий и равномерный мазок диаметром около 1-1,5 см. Если исследуют жидкий материал, то его непосредственно петлей наносят на предметное стекло и готовят мазок. Мазки высушивают на воздухе.
Для фиксации используют физические и химические методы. Для фиксации мазка физическим методом предметное стекло медленно проводят 3 раза через пламя горелки. Мазки крови, мазки-отпечатки органов и тканей фиксируют химическим методом путем погружения их на 5-20 минут в метиловый или этиловый спирт, смесь Никифорова и другие фиксирующие жидкости.
Для окрашивания микробов простые и сложные методы. При простом методе фиксированный мазок окрашивают каким-либо одним красителем, например, водным раствором фуксина (1-2 минуты) или метиленовым синим (3-5 минут), промывают водой, высушивают и микроскопируют. Сложные методы окрашивания предполагают использование нескольких красителей. Это позволяет выявить определенные структуры клеток и дифференцировать одни виды микроорганизмов от других.
Окраска по Граму:
1. На фиксированный мазок наносят карболово-спиртовый раствор генцианового фиолетового через полоску фильтровальной бумаги. Через 2-3 минуты бумагу снимают, а краситель сливают.
2. Наносят раствор Люголя на 1-2 минуты.
3. Обесцвечивают препарат этиловым спиртом в течение 30-60 секунд до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.
4. Промывают препарат водой.
5. Докрашивают мазок водным раствором фуксина в течение 1-2 минут, промывают водой, высушивают и микроскопируют.
Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, грамотрицательные – в красный цвет.
Структура бактериальной клетки
Структурные компоненты бактериальной клетки делят на 2 вида:
- основные структуры (клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана с ее производными, цитоплазма с рибосомами и различными включениями, нуклеоид);
- временные структуры (капсула, слизистый чехол, жгутики, ворсинки, эндоспоры, образующиеся лишь на определенных этапах жизненного цикла бактерий).
Основные структуры.
Клеточная стенка находится с внешней стороны от цитоплазматической мембраны. Цитоплазматическая мембрана не входит в состав клеточной стенки. Функции клеточной стенки:
- защита бактерий от осмотического шока и других повреждающих факторов;
- определение формы бактерий;
- участие в метаболизме бактерий.
Клеточная стенка пронизана порами, через которые происходит транспорт экзотоксинов бактерий. Толщина клеточной стенки составляет 10–100 нм. Основной компонент клеточной стенки бактерий - пептидогликан или муреин, состоящий из чередующихся остатков N-ацетил-N-глюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных гликозидными связями.
В 1884 году Х. Грам предложил метод окраски бактерий с помощью генцианвиолета, йода, этилового спирта и фуксина. Все бактерии в зависимости от окраски по Граму подразделяют на 2 группы: грамположительные и грамотрицательные бактерии. Клеточная стенка грамположительных бактерий плотно прилегает к цитоплазматической мембране, ее толщина составляет 20-100 нм. В ней имеются тейхоевые кислоты (полимеры глицерина или рибита), а также в небольших количествах полисахариды, белки и липиды. Клеточная стенка грамотрицательных бактерий многослойна, ее толщина составляет 14-17 нм. Внутренний слой (пептидогликан) образует тонкую непрерывную сетку. Внешний слой состоит из фосфолипидов, липопротеина и белков. Белки наружной мембраны прочно связаны с пептидогликановым слоем.
Различное содержание пептидогликана в клеточной стенке обусловливает различную окраску бактерий. У грамотрицательных бактерий содержание пептидогликана составляет 1-10%, а у грамположительных – от 50 до 90%. Грамположительные бактерии окрашиваются в синий (фиолетовый) цвет, а грамотрицательные бактерии – в красный цвет.
В некоторых условиях бактерии лишаются способности полностью или частично синтезировать компоненты клеточной стенки, в результате чего образуются протопласты, сферопласты и L-формы бактерий. Сферопласты – это бактерии с частично разрушенной клеточной стенкой. Они наблюдаются у грамотрицательных бактерий. Протопласты - это формы, полностью лишенные клеточной стенки. Они образуются грамположительными бактериями. L-формы бактерий - это мутанты бактерий, частично или полностью утратившие способность синтезировать пептидогликан клеточной стенки (бактерии с дефектной клеточной стенкой). Свое название они получили от названия института Листера в Англии, где были открыты в 1935 году.
Цитоплазматическая мембрана (ЦПМ) и ее производные. Цитоплазматическая мембрана (плазмолемма) - это полупроницаемая липопротеидная структура бактериальной клетки, отделяющая цитоплазму от клеточной стенки. Она составляет 8-15% сухой массы клетки. Ее разрушение приводит к гибели клетки. При электронной микроскопии выявлено ее трехслойное строение. Цитоплазматическая мембрана представляет собой комплекс белков (50-75%) и липидов (15-20%). Основная масса липидов представлена фосфолипидами. Кроме того, в составе мембраны обнаружено небольшое количество углеводов.
ЦПМ бактерий выполняет следующие функции:
- барьерная функция (молекулярное “сито”);
- энергетическая;
- избирательный перенос различных органических и неорганических молекул и ионов с помощью специальных переносчиков – транслоказ или пермеаз;
- репликация и последующее разделение хромосомы.
В процессе роста клетки цитоплазматическая мембрана образует многочисленные впячивания (инвагинаты), получившие название мезосом.
Цитоплазма - это содержимое бактериальной клетки, ограниченное цитоплазматической мембраной. Она состоит из цитозоля и структурных элементов.
Цитозоль - гомогенная фракция, включающая растворимые компоненты РНК, ферменты, продукты метаболизма.
Структурные элементы - это рибосомы, внутрицитоплазматические мембраны, включения и нуклеоид.
Рибосомы - органоиды, осуществляющие биосинтез белка. Они состоят из белка и РНК. Представляют собой гранулы диаметром 15-20 нм. Одна бактериальная клетка содержит от 5000 до 50000 рибосом. Рибосомы являются местом синтеза белка.
В цитоплазме прокариотов обнаруживаются различные включения, представляющие запасные вещества клетки. Из полисахаридов в клетках откладываются гликоген, крахмал и крахмалоподобное вещество - гранулеза. Полифосфаты содержатся в гранулах, называемых волютиновыми, или метахроматиновыми, зернами.
Нуклеоид является ядром у прокариотов. Он состоит из одной замкнутой в кольцо двуспиральной нити ДНК, которую рассматривают как бактериальную хромосому. У нуклеоида отсутствует ядерная оболочка.
Кроме нуклеоида в бактериальной клетке обнаружены внехромосомные генетические элементы – плазмиды, которые представляют собой небольшие кольцевые молекулы ДНК, способные к автономной репликации. Роль плазмид состоит в том, что они кодируют дополнительные признаки, дающие клетке преимущества в определенных условиях существования. Наиболее распространены плазмиды, детерминирующие признаки антибиотикорезистентности бактерий (R-плазмиды), синтез энтеротоксинов (Ent-плазмиды) или гемолизинов (Hly-плазмиды).
К временным структурам относятся капсула, жгутики, пили, эндоспоры бактерий.
Капсула - это слизистый слой над клеточной стенкой бактерии. Вещество капсул состоит из нитей полисахаридов. Капсула синтезируется на наружной поверхности цитоплазматической мембраны и выделяется на поверхность клеточной стенки в специфических участках.
Функции капсулы:
- место локализации капсульных антигенов, определяющих вирулентность, антигенную специфичность и иммуногенность бактерий;
- защита клеток от механических повреждений, высыхания, токсических веществ, заражения фагами, действия защитных факторов макроорганизма;
- способность прикрепления клеток к субстрату.
Жгутики – это органы движения бактерий. Жгутики не являются жизненно важными структурами, поэтому могут присутствовать у бактерий или отсутствовать в зависимости от условий выращивания. Количество жгутиков и места их расположения у разных бактерий неодинаково. В зависимости от этого выделяют следующие группы жгутиковых бактерий:
- монотрихи – бактерии с одним полярно расположенным жгутиком;
- амфитрихи – бактерии с двумя полярно расположенными жгутиками или имеющие по пучку жгутиков на обоих концах;
- лофотрихи – бактерии, имеющие пучок жгутиков на одном конце клетки;
- перитрихи – бактерии с множеством жгутиков, расположенных по бокам клетки или на всей ее поверхности.
Химический состав жгутиков представлен белком флагеллином.
К поверхностным структурам бактериальной клетки относятся также ворсинки и пили. Эти структуры участвуют в адсорбции клеток на субстрате (ворсинки, пили общего типа) и в процессах переноса генетического материала (половые пили). Они образованы специфическим гидрофобным белком пилином.
У некоторых бактерий в определенных условиях образуются покоящиеся формы, которые обеспечивают переживание клеток в течение длительного времени в неблагоприятных условиях - эндоспоры. Они устойчивы к неблагоприятным факторам внешней среды.
Расположение спор в клетке:
- центральное (возбудитель сибирской язвы);
- субтерминальное - ближе к концу (возбудитель ботулизма);
- терминальное – на конце палочки (возбудитель столбняка).