6. Тинкториальные свойства микробов. Красители. Простые способы окраски фиксированных препаратов.

Для количественного учета, изучения морфологии, выявления спор, капсул, органоидов, включений мазок необходимо зафиксировать и окрасить. Мазок готовят на обезжиренном стекле, на который наносят небольшое количество воды. В этой капле эмульгируют исследуемый материал, который распределяют тонким слоем на поверхности около 2 см.. Если культура в жидкой среде, то его берут петлей или стерильной пипеткой и каплю наносят непосредственно на стекло (без воды). После этого мазок высушивают на воздухе и фиксируют. В процессе фиксации микробные клетки погибают, этим достигается безопасность работы с ними, что особенно важно для работы с патогенными микроорганизмами. Убитые микроорганизмы лучше воспринимают красители, чем живые. Кроме того, в фиксированном мазке клетки прикрепляются к стеклу и не смываются при последующей обработке.

Методы фиксации. Физический метод – фиксация мазка над пламене горелки или спиртовки в течение нескольких секунд мазком вверх. Химический метод – более мягкий. При этом мазок погружают в фиксатор на определенное время или жидкость наливают на мазок. В качестве фиксаторов используют: 1) этанол – 10-15 мин; 2) ацетон – 5 мин; 3) смесь Никифорова (этанол+эфир – 1:1) – 1015 мин; 4) метанол – 3 мин; 5) формалин (несколько секунд). После фиксации мазок можно окрашивать.

Окраску мазков производят простым или сложными методами. При простых методах мазок окрашивают каким либо одним красителем, используя красители анилинового ряда (кислые). Наливают краситель на фиксированный мазок на определенное время и смывают водой, высушивают и микроскопируют в иммерсионной системе. Сложные методы окраски применяют для изучения структуры клетки и дифференсации микроорганизмов при этом используют несколько красителей, в некоторых случаях спирты, кислоты.

7. Принципы классификации патогенных прокариот (Берджи, 2001).

Все микроорганизмы различаются друг от друга по многим признакам, и прежде всего по уровню организации геномов, наличию и составу белоксинтезирующих систем и клеточной стенки. В соответствии с этими признаками все известные живые существа делят на 4 царства: Эукариоты, эубактерии, архебактерии, вирусы и плазмиды. К прокариотам, объединяющим эубактерии и архебактерии, относятся бактерии, низкие водоросли, спирохеты, актиномицеты, риккетсии, микоплазмы. Простейшие, дрожжи и нитчатые грибы – эукариоты. Систематика занимается описанием видов организмов, выяснением степени родственных отношений между ними и объединением их в различные классификационные единицы (таксоны). Основной таксономической единицей в биологии является вид. Последующие таксономические единицы: род, семейство, порядок и класс. Это обязательные категории. Подрод, подриба, триба, подсемейство подпорядок, подкласс – дополнительные категории. Согласно определителю Берги, царство прокариот в зависимости от характера их клеточных стенок разделено на 4 большие группы, или отдела.

1) Грациликуты или тонкокожие – к нему относятся грамположительные бактерии.

2) Фирмикуты или толстокожие – к нему относятся грамположительные бактерии.

3) Тенерикуты или нежнокожие – организмы, не имеющие клеточной стенки – микоплазмы.

4) Мендосикуты – бактерии, большинство из которых хотя и имеют клеточную стенку, но она не содержит пептидогликана – сюда относятся архебактерии.

По классификации Берги все прокариоты делятся на 17 частей. Для обозначения видов бактерий используют бинарную номенклатуру, состоящую из названия рода (пишется с заглавной буквы) и вида (пишется всегда со строчной буквы и состоит из одного слова).

Бактериологические, вирусологические лаборатории входят в состав санитарно-эпидемиологических станций (СЭС) и крупных больниц. В лабораториях СЭС выполняются бактериологические, вирусологические, серологические анализы материалов полученных от больных и контактирующих с ними лиц, обследуются бактерионосители и проводятся санитарно-микробиологические исследования воды, воздуха, почвы, пищевых продуктов и пр. В бактериологических и серологических лабораториях больниц проводятся диагностические исследования при кишечных и гнойных инфекциях (дифтерии, туберкулеза и др.), а также исследования по контролю за качеством дезинфекции и стерилизации. Диагностика особо опасных инфекций (чумы, холера, туляремия, бруцеллез, сибирская язва и др.) проводятся в специальных лабораториях. В вирусологических лабораториях проводятся диагностика заболеваний вызванных вирусами (грипп, корь, краснуха, клещевой энцефалит, полиомиелит и др.) хламидиями (орнитоз и др.) и риккетсиями (сыпной тиф, Ку-лихорадка и др.)

В каждой лаборатории предусмотрены следующие помещения:

1) бокс для работы с отдельными группами бактерий или вирусами в асептических условиях;

2) специально оборудованное помещение для стерилизации (автоклавная), для стерилизации питательных сред, посуды, обеззараживания отработанного инфицированного материала;

3) моечная, оборудованная для мытья посуды;

4) оборудованная комната для иммунологических (серологических) исследований;

5) помещение для приготовления питательных сред;

6) помещение для приготовления препаратов и посевов;

7) виварий с боксами для содержания лабораторных животных;

8) регистратура для приема, выдачи анализов.

Лаборатории оснащены следующими оборудованием: биологическими иммерсионными микроскопами, с дополнительными приспособлениями (осветитель, фазово-контрастное устройство, темнопольный конденсор и др.), люминесцентным микроскопом, термостатами, анаэростатами, приборами для стерилизации (автоклав, сушильный шкаф), рН-метрами, дистиллятором, центрифугами, весами аппаратурой для фильтрования, водяными банями, холодильниками, аппаратом для изготовления ватно-марлевых пробок, набором инструментов (бактериологические петли, шпатели, иглы, пинцеты и др.), лабораторной посудой (пробирки, колбы, чашки Петри, флаконы, ампулы, пипетки и др.). Все помещения лаборатории должны быть обеспечены вентиляцией, водопроводом, канализацией, электроэнергией. Стены должны быть окрашены масляной краской или покрыты кафельной плиткой, пол линолеум. В крупных лабораториях имеются термостатные комнаты для массового выращивания микроорганизмов. Каждое рабочее место лаборатории должно быть снабжено газовой горелкой или спиртовкой, банкой с дезинфицирующим раствором. Лабораторные столы оборудуются микроскопом с осветителем, набором красителей и реактивов для окраски препаратов, бактериальными петлями, крючком, иглой, шпателем, Пастеровскими и градуированными пипетками, предметными и покровными стеклами, пинцетами, ванночкой для приготовления и окраски мазков, ватой в стеклянном сосуде, карандашом по стеклу, фильтровальной бумагой.

Учитывая, что работа в микробиологической лаборатории медицинского учреждения проводится с возбудителями инфекционных заболеваний, персонал для предохранения от заражения, должен строго соблюдать правила внутреннего порядка:

1) Входить в лабораторию и работать в ней только в медицинских халатах, шапочках и в сменной обуви. В необходимых случаях персонал надевает на лицо маску из марли. Работа с особо опасными микроорганизмами регламентируется спец. инструкцией и проводится в режимных лабораториях.

2) В лабораториях запрещается принимать пищу, курить.

3) Рабочее место должно содержаться в образцовом порядке, личные вещи сотрудников следует хранить в специально отведенном месте.

4) При случайном попадании инфекционного материала на стол, пол, одежду, обувь это место необходимо обработать дезинфицирующим раствором.

5) Использованные пипетки, предметные стекла, шпатели, ватные тампоны необходимо помещать в сосуд с дезинфицирующим раствором. Пинцеты, бактериальные петли, иглы следует прожигать в пламени горелки.

6) Обработанные культуры, использованный микробный материал, трупы зараженных животных необходимо сдавать для обеззараживания.

7) Хранение, наблюдение за культурами микроорганизмов и их уничтожение должны проводится согласно специальной инструкции. Все культуры патогенных микроорганизмов регистрируются в специальном журнале.

8) По окончании работы руки следует тщательно вымыть, а при необходимости обработать дезинфицирующим раствором.

6