1. Теоретическая часть

   1. Окислительное фосфорилирование (ОФ). Пункты фосфорилирования. Коэффициент P/О ‑ показатель степени сопряжения ОФ. Механизмы сопряжения окисления и фосфорилирования. Хемиосмотическая теория сопряжения окислительного фосфорилирования П. Митчелла. Разобщение окисления и фосфорилирования. Разобщители, виды, их механизм действия. Биологическое значение разобщения ОФ.

   2. Значение тканевого дыхания в биоэнергетике клетки и организма. Энергетический баланс одного оборота ЦТК.

   3. Микросомальное окисление. Понятие о микросомах. Характеристика ЭПС. Микросомальная ДЦ. Основные переносчики: NAD⁺, NADP⁺, FAD и FMN ‑ зависимые дегидрогеназы, цитохромы b₅, P₄₅₀, их функции. Субстраты и косубстраты микросомального окисления (метаболизм ксенобиотиков).

   4. Сходство и отличие микросомальной и митохондриальной ДЦ. Связь ЦТК, ДЦ митохондрии с микросомальной ДЦ. Биологическое значение и органное распределение микросомального окисления.

   5. Перекисное окисление. Электронное строение атома кислорода. Механизмы образования активных форм кислорода. Перекисное окисление в норме и при патологии. Субстраты перекисного окисления. Антиоксидантная защита (АОЗ): ферментная (СОД, каталаза, пероксидаза и др.) и неферментная (глутатион, витамины А, С, Е, метаболиты, и др.). Витамины A, C, E их строение и роль в обмене.

   6. Окислительный стресс как результат нарушения баланса между реакциями перекисного окисления и системой АОЗ.

2. Практическая часть

   1. Решение задач.

   2. Лабораторная работа.

   3. Проведение контроля конечного уровня знаний.

Задачи

1. Фермент, который осуществляет перенос электронов непосредственно на кислород:

а) гексокиназа; б) супероксиддисмутаза; в) пероксидаза; г) цитохромокси­даза?

11. Компонент цепи переноса электронов и протонов, который собирает электроны от разных субстратов окисления:

а) НАДН-дегидрогенеза; б) цитохром c; в) убихинон (КоQ)?

12. Разобщение дыхания и фосфорилирования достигается при:

1. повышении проницаемости внутренней мембраны митохондрий для протонов;

2. снижении активности Н⁺ зависимой АТФ-азы;

3. ингибировании АДФ-АТФ транслоказы?

13. Атомы и железа, и меди входят в активный центр фермента...

а) цитохрома c; б) цитохромоксидазы; г) НАДН-дегидрогеназы; д) убихинолдегидрогеназы; е) сукцинатдегидрогеназы?

14. Убихинон легко диффундирует в мембране митохондрий, потому что является...

1. небольшой гидрофильной молекулой;

2. небольшой липофильной молекулой;

3. крупной липофильной молекулой;

4. крупной гидрофильной молекулой?

15. Коэффициентом фосфорилирования называется:

1. отношение количества связанной Н₃РО₄ к количеству поглощенного О₂;

2. отношение объемов образующегося СО₂ и поглощаемого О₂;

3. отношение количества энергии, аккумулированного АТФ, к энергии, высвободившейся при окислении?

16. Разобщитель окислительного фосфорилирования:

а) токоферол; б) динитрофенол; в) цианистый калий; г) амитал?

17. Согласно хемиосмотической теории протоны «возвращаются» из межмембранного пространства в матрикс митохондрий:

1. при помощи ферментов дыхательной цепи;

2. в любом месте мембраны по градиенту концентрации;

3. через протонную АТФ-синтазу?

18. В метаболизме чужеродных соединений участвует фермент:

а) супероксиддисмутаза; б) цитохром b; в) цитохром c1; г) цитохром Р450; д) сукцинатдегидрогеназа?

19. Протонная АТФ-синтаза для образования АТФ использует энергию:

1. трансмембранного протонного градиента;

2. макроэргической связи промежуточного соединения;

3. заключенную в НАДФН?

20. Фермент микросомального окисления цитохром Р₄₅₀ локализован в…:

а) митохондриях; б) рибосомах; в) лизосомах; г) эндоплазматической сети?

21. Фермент, защищающий клетку от токсического действия кислорода:

а) НАДН-дегидрогеназа; б) моноаминооксидаза; в) цитохромоксидаза; г) супероксиддисмутаза?

22. Ингибитор перекисного окисления липидов (ПОЛ):

а) токоферол; б) цианистый калий; в) тироксин; г) арахидоновая кислота; д) пируват?

23. Угарный газ (СО) нарушает биоэнергетические процессы, потому что блокирует:

а) АТФ-синтазу; б) цитохромоксидазу; в) цитохром b; г) сукцинат­дегидрогеназу?

24. Разобщители нарушают синтез АТФ, потому что:

1. блокируют АТФ-синтазу;

2. уменьшают трансмембранный потенциал;

3. ингибируют цитохромоксидазу;

4. разрушают митохондрии?

Лабораторная работа. Количественное определение каталазы по Баху и Зубковой

Принцип метода. Основан на титриметрическом определении количества перекиси водорода, расщепленной ферментом за определенный промежуток времени, по следующему уравнению:

2KMnO₄ + 5H₂O₂ + 3H₂SO₄  K₂SO₄ + 2MnSO₄ + 8H₂O + 5O₂

2KMnO₄ + 5H₂O₂ + 4H₂SO₄  2KHSO₄ + 2MnSO₄ + 8H₂O + 5O₂

KMnO₄+H₂O₂+H₂SO₄  O₂+MnSO₄+K₂S +H₂O

О количестве расщепленной перекиси водорода судят по разности количества KMnO₄, израсходованного на титрование до и после действия каталазы.

Активность каталазы выражают с помощью каталазного числа и показателя каталазы. Каталазным числом называют количество миллиграммов перекиси водорода, которое разлагается в 1 мкл крови.

Ход работы. Разведенную кровь (1 : 1000) взбалтывают и добавляют по 1 мл в две колбы, приливают по 7 мл дистиллированной воды; в опытную пробу добавляют 2 мл 1 % раствора H₂O₂, а в контрольную – 5 мл 10 % раствора H₂SO₄. Действие каталазы в кислой среде (в контрольной пробе) прекращается, т. к. оптимум pH = 7,4.

Колбы оставляют при комнатной температуре на 30 мин. Затем приливают в опытную колбу 5 мл 10 % H₂SO₄, а в контрольную – 2 мл 1 % H₂O₂. Содержимое каждой колбы титруют 0,1н раствором KMnO₄ до появления бледно-розовой окраски.

Рассчитывают каталазное число (КЧ) по формуле

КЧ = (А – В)  1,7,

где А – количество 0,1н раствора KMnO₄, пошедшее на титрование контрольной пробы, где каталаза разрушена, мл;

В – количество 0,1н раствора KMnO₄, пошедшее на титрование опытной пробы, мл.

На титрование контрольной пробы, где каталаза разрушена, пойдет больше раствора KMnO₄, чем на титрование опытной пробы. Полученную разность умножают на 1,7 (коэффициент пересчета) и получают каталазное число для исследуемой крови.

В норме каталазное число составляет 10–15 единиц.

Клинико-диагностическое значение. Определение активности каталазы крови имеет значение для диагностики рака, анемии, туберкулеза. При этих заболеваниях активность каталазы в крови снижается.

Примечание ‑ Показателем каталазы служит дробь, в которой числителем является каталазное число, а знаменателем – число миллионов эритроцитов в 1 мкл исследуемой крови.

Выводы. Записать полученный результат и дать его клинико-диагности­ческую оценку.

_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Рекомендуемая литература

Основная

1. Кухта, В.К и др. Биологическая химия: учебник / В.К. Кухта, Т.С. Морозкина, Э.И. Олецкий, А.Д. Таганович; под ред. А.Д. Тагановича. – Минск: Асар, М.: Издательство БИНОМ, 2008. – С. 135-154, 110-120, 424-426.

2. Биохимия: Учебник для вузов / Под ред. Е.С. Северина. – 4-е изд., испр. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006. – С. 274-281, 294-296, 130-137, 428-432, 618-621.

3. Филиппович, Ю. Б. Основы биохимии. – 4-е изд. – М.: Агар, 1999. – С. 118-123, 151-159, 170-172, 417-430, 71.

4. Николаев, А.Я. Биологическая химия. М.: Медицинское информационное агентство, 2004. – С. 224-235, 452-459.

5. Марри Р. и др. Биохимия человека: в 2-х т.: Пер. с англ., М.: Мир, 2004. – Т.1: С. 118-139, 281-282.

6. Березов, Т. Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. – М.: Медицина, 1998. – С. 305–317.

Дополнительная

7. Ленинджер А. Основы биохимии. М.: Мир, 1985. Т. 2. С. 403–438, 508–550.

8. Албертс Б. и др., Молекулярная биология клетки. М.: Мир, 1994. Т. 1. С. 430–459.

9. Скулачев В.П. Энергетика биологических мембран. М.: Наука. 1989.

Занятие 8

Контрольное занятие по разделам «Введение в биохимию», «Энзимология и Биологическое окисление»

Цель занятия: контроль усвоения тем раздела.

1. Краткая история биохимии. Значение биохимии для врача.

2. Характеристика основных биохимических методов.

3. Строение, свойства, классификация и биологическая роль аминокислот.

4. Структура, физико-химические свойства пептидов, их значение для организма.

5. Физико-химические свойства и функции белков.

6. Уровни структурной организации, форма и размеры белковых молекул.

7. Качественные реакции на белки и аминокислоты.

8. Высаливание и денатурация: механизмы, применение в лечебной и лабораторной практике.

9. Количественное определение общего белка в сыворотке крови биуретовым методом (принцип метода, диагностическое значение).

10. История энзимологии. Свойства ферментов. Сходство и отличие ферментативного и неферментативного катализа.

11. Доказательства белковой природы фермента. Выделение и очистка ферментов.

12. Структурно-функциональная организация ферментов. Кофакторы и коферменты.

13. Механизм действия ферментов. Теория промежуточных соединений. Термодинамика ферментативного катализа.

14. Факторы, влияющие на скорость ферментативных реакций.

15. Кинетика ферментативных реакций. K_m – определение, физиологическое значение.

16. Механизмы регуляции активности ферментов. Виды ингибирования.

17. Аллостерические ферменты. Особенности строения и функционирования, свойства и биологическая роль.

18. Качественное обнаружение и количественное определение активности ферментов. Единицы измерения количества и активности ферментов.

19. Номенклатура и классификация ферментов.

20. Локализация ферментов в клетке. Органоспецифические и маркерные ферменты. Изменения ферментативного спектра в онтогенезе.

21. Изоферменты, их биологическая роль и происхождение. Использование изоферментов в диагностике.

22. Энзимопатии, их классификация, причины возникновения. Степень клинических проявлений энзимопатий.

23. Механизм развития нарушений при энзимопатиях (первичные и вторичные метаболические блоки).

24. Энзимодиагностика. Принципы, задачи и объекты исследования.

25. Количественное определение активности амилазы по Вольгемуту (принцип метода, диагностическое значение).

26. Количественное определение активности каталазы по Баху и Зубковой (принцип метода, диагностическое значение).

27. Применение ферментов в лабораторной диагностике.

28. Энзимотерапия, способы и цели применения. Иммобилизованные ферменты, липосомы.

29. История развития учения о биологическом окислении (БО).

30. Основная роль БО в процессах жизнедеятельности. Пути утилизации кислорода в организме.

31. Принципы преобразования и передачи энергии в живых системах. Окислительно-восстановительный потенциал.

32. Этапы биологического окисления. Схема образования и превращения основных энергетических субстратов.

33. Макроэргические соединения, причины макроэргичности. Строение, способы образования и роль АТФ.

34. Строение и функции митохондрий. Сравнительная характеристика мембран митохондрий. Локализация митохондриальных ферментов.

35. Цикл трикарбоновых кислот Кребса (ЦТК) как общий конечный пункт утилизации субстратов биологического окисления. История открытия ЦТК. Последовательность реакций, ферменты, коферменты ЦТК. Регуляция и биологическая роль ЦТК. Энергетический баланс одного оборота ЦТК.

36. Ферменты, коферменты биологического окисления.

37. Строение и роль в энергетическом обмене витаминов РР(В₅), В₂, С.

38. Строение и роль в процессах биологического окисления витаминов А, Е, С.

39. Митохондриальная дыхательная цепь (ДЦ). Основные принципы и механизмы функционирования. Комплексы ДЦ.

40. Механизмы сопряжения окислительного фосфорилирования. Строение и функции протонной АТФ-азы. Коэффициент Р/О.

41. Хемиосмотическая теория Митчелла. Н⁺, его структура, механизм генерации и пути утилизации.

42. Разобщение окисления и фосфорилирования. Разобщители окислительного фосфорилирования, их природа и механизм действия. Ингибиторы ДЦ.

43. Особенности митохондриального окисления в бурой жировой ткани, ее биологическая роль.

44. Микросомальная дыхательная цепь. Механизм и биологическая роль микросомального окисления.

45. Сходство и отличие микросомального и митохондриального окисления. Связь ЦТК, ДЦ митохондрии с микросомальной ДЦ.

46. Механизмы образования активных форм кислорода, их биологическая роль.

47. Перекисное окисление в норме и при патологии.

48. Ферментативная и неферментативная антиоксидантная защита (АОЗ). Механизмы действия и биологическая роль. Анти- и прооксиданты.