3.3.Ізоелектрична точка білків
Уводному середовищі розчинні білки мають певний заряд. Величина і знак заряду залежать від кількості іонізованих амінота карбоксильних груп амінокислот, що входять до складу даного білка.
Іонізація карбоксильних |
груп |
|
глутамінової та аспарагінової |
|
кислот |
|||||||||||||||
надають білковій молекулі негативного заряду, а іонізація аміногруп лізину та |
||||||||||||||||||||
аргініну – |
позитивного. |
Більшість білків мають |
|
негативний |
заряд, тобто |
є |
||||||||||||||
кислими білками. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
За певного значення рН середовища ступінь дисоціації карбоксильних та |
||||||||||||||||||||
аміногруп |
зрівнюється, |
і молекула |
білка стає електронейтральною. Таке |
|||||||||||||||||
значення рН розчину називаєтьсяізоелектричною точкою. Для кислих білків |
||||||||||||||||||||
значення ізоелектричної точки лежить в області рН менше7,0, в якій |
||||||||||||||||||||
пригнічується дисоціація карбоксильних груп: |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||
|
|
|
|
COO- |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
COOН |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
рН<7 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
+ |
|
|
|
+ |
|
|
|
|
|
|
|
|||||
|
|
білок |
|
NH3 |
+ |
|
|
білок |
|
|
|
NH3 |
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||
|
|
|
|
|
[H ] |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
COO- |
|
|
|
|
|
|
|
|
COO- |
|
|
|
|
|
|
|
Для лужних білків значення ізоелектричної точки лежить в області рН |
||||||||||||||||||||
більше 7,0, в якій пригнічується дисоціація аміногруп: |
|
|
|
|
|
|
||||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
COO- |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
COO- |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
COO- |
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||
білок |
|
NH3+ |
|
|
|
|
|
|
|
|
білок |
|
|
|
NH2 |
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||
|
|
рН>7 |
|
білок |
|
|
NH3ОН |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
|
|
[ОH-] |
|
|
|
|
|
|
- H2О |
|
|
|
NH3+ |
|
|
|||||
|
+ |
|
|
|
|
|
NH3+ |
|
|
|
|
|
||||||||
|
|
NH3 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
Розчини білків в ізоелектричній точці нестійкі та легко випадають в осад. Мета роботи: засвоєння поняття ізоелектричної точки білка та методики
її визначення.
Завдання на виконання роботи: визначити ізоелектричну точку розчину казеїну.
Лабораторний посуд: пробірки; піпетки.
Матеріали та реактиви: 0,1 н розчин оцтової кислоти; 0,01 н розчин оцтової кислоти; 0,5 %-й розчин казеїну в 1 н розчині натрій оцтовокислого.
Принцип методу ґрунтується на створенні різних значень рН середовища і визначенні ізоелектричної точки у пробірці з найбільшим осадом казеїну.
Хід роботи. У вісім пробірок наливають по 1 мл розчину казеїну і додають у певних співвідношеннях розчини оцтової кислоти для утворення різної реакції середовища, згідно з табл. 3.1:
19
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Таблиця 3.1 |
|
|
|
Приготування розчинів білка з різним значенням рН середовища |
|
||||||||
Розчини, мл |
|
|
|
|
Номер пробірки |
|
|
|
|||
|
|
|
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
Розчин казеїну |
|
1,0 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
1,0 |
||
0,01 |
н |
розчин |
|
0,6 |
1,25 |
– |
– |
– |
– |
– |
– |
СН3СООН |
|
– |
– |
0,25 |
0,50 |
1,0 |
2,0 |
4,0 |
8,0 |
||
0,1 |
н |
розчин |
|
||||||||
СН3СООН |
|
8,4 |
7,75 |
8,75 |
8,5 |
8,0 |
7,0 |
5,0 |
1,0 |
||
Вода |
|
|
|||||||||
Значення рН |
|
5,9 |
5,6 |
5,3 |
5,0 |
4,7 |
4,4 |
4,1 |
3,8 |
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Пробірки витримують при кімнатній температурі протягом30 хв.
Визначають |
ізоелектричну |
точку |
казеїну |
за |
максимальним |
ступен |
помутніння. |
|
|
|
|
|
|
Аналізують одержані результати, складають висновки і рекомендації. |
|
|||||
|
3.4. Осадження білків |
|
|
|
||
|
3.4.1. Осадження білків солями важких металів |
|
||||
Мета |
роботи: засвоєння |
механізму |
осадження |
білків солями важких |
||
металів.
Завдання на виконання роботи: осадити білки розчинами солей важких металів з подальшим розчиненням утворюваного осаду білків надлишком цих
солей. |
|
Лабораторний посуд: пробірки; піпетки; скляні палички. |
|
Матеріали |
та реактиви: 10 %-й розчин купрум сірчанокислого; 5 – |
10 %-й розчин |
плюмбум оцтовокислого; розчин білка (білок одного яйця |
розбавити дистильованою водою у20 разів, перемішати і відфільтрувати через 2 – 3 шари марлі).
Принцип методу. Солі важких металів (міді, ртуті, цинку, срібла, свинцю)
осаджують білки в результаті утворення |
нерозчинних |
у воді комплексних |
||||||||
сполук |
із |
сульфгідрильними |
групами |
. білківЦю |
властивість |
білків |
||||
використовують у медицині. Наприклад, білки молока, яєць використовують |
||||||||||
для рятування людей, отруєних солями |
|
ртуті, свинцю, |
міді |
тощо, як |
||||||
протиотруйний засіб. |
|
|
|
|
|
|
|
|
||
Осад |
|
білка в надлишку |
солей |
|
деяких |
важких |
(плюмбумметалів |
|||
оцтовокислого, купрум сірчанокислого) розчиняється. Це пов'язано з тим, що |
||||||||||
надлишок іонів цих металів, адсорбуючись |
на поверхні білкових часток, |
|||||||||
викликає |
перезарядження |
білкового |
комплексу, в |
результаті |
чого |
він |
||||
переходить у розчин. Це явище називається адсорбційною пептизацією.
Хід роботи. У дві пробірки наливають по3 мл розчину яєчного білка і додають: у першу – 2 – 3 краплини розчину купрум сірчанокислого, у другу – 2
– 3 краплини розчину плюмбум оцтовокислого. Спостерігають утворення осаду (із сіллю купруму– блакитного кольору, плюмбуму – білого). При додаванні надлишку розчинів цих солей відбувається розчинення утвореного осаду.
20
3.4.2. Осадження білків органічними розчинниками
Мета роботи: засвоєння механізму осадження білків органічними розчинниками.
Завдання на виконання роботи: осадити білки етиловим спиртом та ацетоном з додаванням натрій хлориду.
Лабораторний посуд: пробірки; піпетки.
Матеріали та реактиви: 1 %-й розчин яєчного білка; кристалічний
натрій хлорид; |
96 %-й розчин спирту етилового; 95 %-й розчин ацетону. |
Принцип методу. Білки осаджуються з розчинів при додаванні до них |
|
деяких органічних розчинників(ацетон, етанол, хлороформ тощо). Органічні |
|
розчинники |
зменшують діелектричну постійну водних розчинів . білків |
Присутність електролітів покращує осадження білків.
Якщо осадження білків проводиться за низьких температур (–15 – 0 °С), то воно є оборотним, і білок відновлює свої біологічні функції.
Хід роботи. У дві пробірки наливають по3 мл розчину яєчного білка і
вносять по 0,2 |
г кристалічного натрій |
хлориду. Вміст пробірок збовтують. |
|
Потім у першу додають краплинами 3 мл етилового спирту, у другу – ацетону і |
|||
знову збовтують. Через 3 – 6 хв спостерігається випадання білка в осад, який |
|||
розчиняють, додаючи воду. |
|
|
|
3.4.3. Осадження білків реактивами на алкалоїди |
|||
Осадження |
білків реактивами на |
алкалоїди– |
це необоротна реакція. |
Алкалоїди являють собою азотисті |
основи, що містять у молекулі різні |
||
гетероцикли з атомами азоту. У білковій молекулі також є деякі гетероцикли, |
|||
що містять азот, тому для білків |
характерні |
деякі реакції, притаманні |
|
алкалоїдам. |
|
|
|
Мета роботи: засвоєння механізму осадження білків реактивами на |
|||
алкалоїди. |
|
|
|
Завдання на виконання роботи: осадити білки реактивами на алкалоїди з |
|||
подальшим розчиненням утвореного осаду надлишком цих реактивів. |
|||
Лабораторний посуд: пробірки; піпетки.
Матеріали та реактиви: 1 %-й розчин яєчного білка; 10 %-й розчин пікринової кислоти; насичений розчин таніну; 5 %-й розчин калій гексаціано- (ІІ)-ферату; 1,0 %-й розчин оцтової кислоти.
Принцип методу. Механізм осадження білків алкалоїдними реактивами (таніном, пікриновою, гексаціановою, фосфорно-вольфрамовою, фосфорномолібденовою, феритовою кислотами та їх солями) зумовлений утворенням нерозчинних сполук цих реактивів з азотистими групами . білкаУтаких
сполуках алкалоїдні реактиви є |
аніонами, а білки – |
катіонами. Для |
надання |
|
|||
молекулі |
білка позитивного |
заряду |
розчин |
білка |
підкислюють |
оцтовою |
|
кислотою. У результаті цього позитивно заряджені |
частки |
білка |
легко |
||||
взаємодіють з негативно зарядженими молекулами |
осаджувача. Білки з |
||||||
позитивним |
зарядом (протаміни, |
гістони) |
добре осаджуються алкалоїдними |
||||
реактивами в середовищі без попереднього підкислення.
Хід роботи. У три пробірки вносять по2 мл розчину яєчного білка та по 0,5 мл розчину 1 %-ної оцтової кислоти. Потім додають по5 – 6 краплин: у
21
першу – розчину пікринової кислоти, у другу – насиченого розчину таніну, у третю – розчину гексоціано-(ІІ)-ферату калію. Спостерігається випадіння осаду. При додаванні надлишку розчину гексаціано-(ІІ)-ферату калію і розчину таніну осад розчиняється.
3.4.4. Осадження білків концентрованими мінеральними кислотами
Мета роботи: засвоєння механізму осадження білків концентрованими
мінеральними кислотами. |
|
|
|
|
|
|
|
||
Завдання |
на |
виконання |
роботи: осадити |
білки |
концентрованими |
||||
нітратною, сульфатною і хлоридною кислотами з подальшим |
розчиненням |
||||||||
осаду надлишком цих кислот. |
|
|
|
|
|
|
|||
Лабораторний посуд: пробірки; піпетки. |
|
|
|
|
|
||||
Матеріали та реактиви: 1 %-й розчин яєчного білка; концентровані |
|
||||||||
нітратна, сульфатна і хлоридна кислоти. |
|
|
|
|
|
||||
Принцип методу. Мінеральні кислоти, крім ортофосфатної, осаджують |
|
||||||||
білки в результаті денатурації й дегідратації білкових молекул. У надлишку всі |
|
||||||||
мінеральні кислоти, |
крім |
нітратної, |
розчиняють |
утворений |
осад |
внаслідок |
|
||
перезарядження білка. |
|
|
|
|
|
|
|
||
Хід роботи. В три пробірки вносять по3 мл розчину яєчного білка й |
|
||||||||
обережно по стінці вливають по декілька краплин: у першу пробірку– |
|
||||||||
концентрованої |
нітратної |
кислоти; |
у другу – |
концентрованої сульфатної |
|
||||
кислоти, а в третю – хлоридної кислоти. Випадає осад. Додають надлишок цих |
|
||||||||
кислот, обережно |
струшують кожну пробірку і спостерігають чи у |
всіх |
|||||||
пробірках відбудеться розчинення осаду. |
|
|
|
|
|
||||
3.4.5. Осадження білків органічними кислотами |
|
|
|||||||
Мета роботи: засвоєння механізму осадження |
білків |
органічними |
|||||||
кислотами. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Завдання |
на |
виконання роботи: осадити |
білки |
трихлороцтовою |
і |
||||
сульфосаліциловою кислотами.
Лабораторний посуд: пробірки; піпетки.
Матеріали та реактиви: 1 %-й розчин яєчного білка; 20 %-й розчин сульфосаліцилової кислоти; 10 %-й розчин трихлороцтової кислоти.
Принцип методу. Деякі органічні кислоти осаджують білки в результаті денатурації та дегідратації білкових молекул, а також у результаті утворення
комплексних солей білків з кислотами. |
|
|
||
Для |
осадження |
білків |
використовують |
трихлороцтову(ТХО) і |
сульфосаліцилову кислоти. ТХО осаджує тільки білки і не осаджує проміжні продукти розпаду білків та амінокислоти. Сульфосаліцилова кислота осаджує не лише білки, а й високомолекулярні пептони і поліпептиди.
Хід роботи. У дві пробірки вносять по 3 мл розчину яєчного білка. В одну додають декілька краплин розчину трихлороцтової кислоти, в іншу – декілька краплин розчину сульфосаліцилової кислоти. В обох пробірках спостерігається випадіння осаду білка.
3.4.6. Осадження білків під час кип’ятіння
Мета роботи: засвоєння механізму осадження білків під час кип’ятіння. Завдання на виконання роботи: здійснити осадження білків при
22