кільксть 0,01 н розчину тіосульфату натрію, витрачена на титрування контролю, мл; n – кількість досліджуваного розчину, яку взята для аналізу, мл.

Додаток 4

Визначення білка в матеріалах і пробах

Метод Лоурі

Метод грунтується на реакції білків з реактивом Фоліна, яка дає синє забарвлення.

Метод застосовують для визначення в розчинах білка з концентрацією від

10 до 100 мкг.

Реактиви

Розчин А: 2%-й розчин Na2CO3 в 0,1 н розчині NaOH;

розчин В: 0,3%-й розчин CuSO4´5H2O в 1 %-му розчині двозаміщеного виннокислого натрію або калію;

розчин С: дослідний розчин, який готують у день визначення(придатний протягом 1 дня), змішуванням 50 мл розчину А і розчину В;

реактив Фоліна: 100 г вольфрамату натрію(Na2WO4´2H2O) і 25 г молібдату натрію (Na2MoO4´2H2O) розчиняють у 700 см3 води, додають 50 см3 85 %-го розчину ортофосфорної і соляної кислот. Суміш кип’ятять протягом 10 год із зворотним холодильником у витяжній шафі. Після цього в колбу додають 150 г сульфату літію, 50 см3 дистильованої води і п‘ять крапель бромної води. Суміш кип’ятять 15 хв у витяжній шафі для видалення надлишку брому, охолоджують і доводять до1 дм3. Реактив фільтрують і зберігають у темній склянці з притертою пробкою. Розчин повинен бути яскраво-жовтого кольору. Розчин можна зберігати тривалий час;

розчин Д: реактив Фоліна, розбавлений водою у співвідношенні 1:1.

Техніка визначення:

До 0,4 см3 розчину білка додають 2 см3 розчину С. Суміш перемішують і через 10 хв приливають до неї0,2 см3 робочого розчину Фоліна. Інтенсивність забарвлення визначають на ФЕК-М з червоним світлофільтр(абом на спектрофотометрі з довжиною хвилі750 нм) через 30 хв. Кількість білка знаходять за калібрувальною кривою.

Для побудови калібрувальної кривої100 мг чистого білка(сироваткого g-глобуліну, кристалічного альбуміну і .)та розчиіняють в 100 см3 0,1 н розчину NaOH (1см3 містить 1 мг білка). У дев‘ять мірних колб на 100 см3 приливають розчин білка у зростаючих кількостях: 0,5 см3, а потім від 1 до 8 см3. Розчин у колбах доводять водою до мітки, перемішують і з кожної колби беруть по 0,4 см3 для визначення концентрації білка калориметричним методом. За одержаними даними креслять калібрувальну криву.

66