2.7.3. Количественное определение кортикотропина

Активность кортикотропина определяют путем сравнения одного или нескольких из его биологических эффектов с аналогичными эффектами Международного Стандарта или препарата сравнения, калиброванного в Международных Единицах при проведении экспериментов в аналогичных условиях.

За Международную Единицу принимают активность установленного количества Международного Стандарта, состоящего из высушенного из замороженного состояния очищенного свиного кортикотропина с добавлением лактозы. Эквивалентность Международного Стандарта в Международных Единицах устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.

Стандартный образец кортикотропин BRP калиброван в Международных Единицах в сравнении с Международным Стандартом.

В испытании используют крыс обоего пола массой тела от 100 до 200 г. Разница в массе тела у самого тяжелого и самого легкого животного должна составлять не более 15 г. Крыс содержат в однородных условиях в течение не менее 7 дней до начала испытания. В день, предшествующий испытанию, крыс взвешивают и проводят гипофизэктомию. После операции крысам обеспечивают доступ к раствору глюкозы R концентрацией 50 г/л и раствору натрия хлорида R концентрацией 1,8 г/л в дополнение к обычной диете и воде и содержат крыс в помещении с постоянной температурой от 24 до 27⁰С. Испытание выполняют через 18-36 часов после гипофизэктомии.

В день испытания повторно взвешивают животных и делят их случайным образом на 6 групп, каждая из которых состоит из 6-8 особей. Выбирают три дозы препарата сравнения и три дозы испытуемого препарата таким образом, чтобы наименьшая доза приводила к некоторому уменьшению, а наибольшая доза не приводила к максимальному уменьшению содержания аскорбиновой кислоты в надпочечниках. Дозы, отрегулированные с учетом массы тела животных, вводят подкожно в случайном порядке. Подходящими обычно являются дозы порядка 1,0, 0,5 и 0,25 МЕ на 100 г массы тела. Если в частной статье нет иных указаний, стандартный и испытуемый препараты растворяют в 0,01 М хлористоводородной кислоте и выполняют последовательные разведения водой R, содержащей желатин R в концентрации 150 г/л. Растворы вводят в течение 4 часов после приготовления.

Через 3 часа после инъекции у анестезированной крысы удаляют обе надпочечные железы, освобождают их от посторонних тканей и по возможности быстро взвешивают для предотвращения потери массы. Крысу умерщвляют и исследуют на предмет полноты гипофизэктомии.

Пару надпочечников измельчают и гомогенизируют в свежеприготовленном растворе метафосфорной кислоты R концентрацией 25 г/л и разбавляют тем же раствором до 10 мл. Гомогенат выдерживают в течение 30 минут, после чего центрифугируют. 7 мл прозрачного супернатанта добавляют к свежеприготовленной смеси, состоящей из 7 мл раствора натрия ацетата R концентрацией 45,3 г/л со значением рН, доведенным до 7 путем добавления уксусной кислоты R, 3 мл воды R и 2 мл стандартного раствора дихлорфенолиндофенола R. Через 30 секунд после смешивания измеряют светопоглощение с помощью колориметра, используя фильтр с максимумом пропускания при 470 нм, в диапазоне пропускания от 450 до 520 нм. Содержание аскорбиновой кислоты вычисляют из стандартной кривой, которую получают аналогичной обработкой подходящих объемов свежеприготовленного раствора аскорбиновой кислоты R в растворе метафосфорной кислоты R концентрацией 25 г/л. Результаты выражают в миллиграммах на 100 г надпочечной железы. Результат количественного определения получают с использованием обычных статистических методов.