2.7.2. Количественное определение антибиотиков микробиологическим методом

Активность антибиотика определяют путем сравнения степени угнетения роста чувствительных микроорганизмов под действием испытуемого антибиотика и стандартного образца в известных концентрациях.

Стандартные образцы, используемые для количественного определения, представляют собой субстанции, активность которых точно установлена по отношению к международному стандарту.

# Для количественного определения используют ФСО.

Определение должно выполняться способом, позволяющим производить проверку достоверности математической модели, на которой основан расчет активности. Если выбрана модель параллельных линий, линии логарифмической зависимости активности от дозы для испытуемого препарата и стандартного образца должны быть параллельны; они должны быть линейны в области доз, использовавшихся при вычислении. Эти условия должны быть проверены тестами соответствия для определенной вероятности, обычно Р = 0,05.

# Вычисления целесообразно проводить по схеме латинских квадратов (если при проведении анализа методом диффузии в агар были использованы прямоугольные кюветы) или по схеме рандомизированных блоков (если при проведении анализа методом диффузии в агар были использованы чашки Петри или анализ проводился турбидиметрическим методом).

Могут быть использованы и другие математические модели, например, модель отношения уклонов прямых, при условии доказательства их достоверности.

Если в частной статье не указано иное, доверительные интервалы ошибки количественного определения активности (Р = 0,95) должны составлять от 95% до 105% от оцениваемой активности.

Определение выполняют методом А или методом В, если иное не указано в частной статье.

А. МЕТОД ДИФФУЗИИ

Питательную среду определенного состава расплавляют, засевают суспензией микроорганизмов, чувствительных к испытуемому антибиотику, при подходящей температуре, например, 48-50°С для вегетативных форм и 65-70°С при использовании суспензии спор. Количество суспензии микроорганизмов выбирают таким образом, чтобы образовывались четко определенные зоны ингибирования требуемого диаметра при концентрациях антибиотика, используемых в определении. Инокулированная среда разливается по чашкам Петри или по прямоугольным кюветам на строго горизонтальной поверхности в количестве, достаточном для формирования однородного слоя толщиной от 2 до 5 мм. Среда может также состоять из двух слоев, из которых только верхний подвергался инокуляции. Чашки хранят таким образом, чтобы не происходило заметного роста или гибели микроорганизмов до использования, а поверхность среды была сухой к моменту использования.

Используя растворитель и буферный раствор, указанный в Таблице 2.7.2.-1, готовят растворы стандартного образца и испытуемого антибиотика, имеющие известные концентрации и предположительно равные активности. Растворы наносят на поверхность среды, например, в стерильных цилиндрах из фарфора, нержавеющей стали или другого подходящего материала, или в лунках, сделанных в агаре. В каждый цилиндр или лунку должны быть помещены равные объемы раствора. Кроме того, можно использовать стерильные диски абсорбирующей бумаги подходящего качества; диски пропитывают растворами стандартного образца и растворами испытуемого антибиотика и помещают на поверхность агара.

Для оценки достоверности количественного определения используют не менее трех доз стандартного образца и трех доз испытуемого антибиотика, имеющих равные предполагаемые активности. Предпочтительно использовать ряды доз, меняющихся в геометрической прогрессии.

• Например, в соотношении 1:2:4.

В рутинных анализах, когда линейность системы продемонстрирована в адекватном количестве экспериментов с определением по трем значениям, по согласованию с компетентными органами может считаться достаточным определение по двум значениям. Однако во всех спорных случаях должно применяться вышеописанное определение по трем значениям.

Растворы в каждой чашке Петри или прямоугольной кювете располагают статистически предпочтительным образом, кроме чашек Петри малого размера, на которых невозможно разместить больше шести растворов; растворы испытуемого антибиотика (U) и стандартного образца (S) чередуют таким образом, чтобы исключить взаимное влияние более концентрированных растворов.

• Последовательность внесения стандартного и испытуемого образцов в цилиндры или лунки каждой чашки рекомендуется следующей: первыми вносятся растворы стандартного и испытуемого образца с малой концентрацией (S₁, U₁), затем со средней концентрацией (S₂, U₂), последними вносят растворы с большими концентрациями (S₃, U₃).

• Все растворы стандартного испытуемого образцов вносят в цилиндры или лунки одной чашки Петри таким образом, чтобы растворы с большими концентрациями не соприкасались между собой. Предлагаемый вариант закапывания S₁ U₃ S₂ U₁ S₃ U₂.

Чашки инкубируют при подходящей температуре около 18 часов. Чашки могут выдерживаться до инкубации при комнатной температуре или, если необходимо, при 4 С⁰ в течение определенного промежутка времени, обычно от 1 до 4 часов для протекания диффузии, что уменьшает эффекты вариаций временных интервалов между нанесением растворов и улучшает качество кривой регрессии.

Измеряют диаметры (с точностью не ниже 0,1 мм) или площади кольцевых зон ингибирования (с соответствующей точностью) и вычисляют активность с использованием подходящих статистических методов.

В каждом определении используют достаточное для получения требуемой точности количество повторов. Может быть проведено несколько определений, результаты которых статистически обработаны для получения требуемой точности и для подтверждения того, что активность испытуемого антибиотика не ниже минимальных требований.

				CIP 54.127 ATCC 10536
#Канамицин В	Канамицина моносульфа­та ФСО	Дистиллированная вода	Буфер № 4, pH 7,8-8,0	Bac.subtilis АТСС 6633	№ 12 pH 7,8­8,0, № 8 pH 7,8-8,0	35-37
#Карбени-циллин	Карбени-циллина динатриевой соли ФСО	Буфер № 1 pH 6,8-7,0	Буфер № 2 pH 5,8-6,0	Pseudomonas aeruginosa NCTC 2134	№ 7 pH 6,8­7,0	35-37
#Кармино-мицин	Кармино-мицина гидрохлорида ФСО	Дистиллированная вода	Буфер № 4, pH 7,8	Bac.cereus var. mycoides 537	№ 5 pH 7,8­8,0	35-37
Канамицина моносульфат Канамицина кислый сульфат	Канамицина моносульфа­та ФСО	Дистиллированная вода	8,0 (0,05 М)	Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633 Staphylococc us aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538 P	A; 7.9 A; 7.9	30-37 35-39
#Леворин	Леворина ФСО	Диметилсульфоксид	Диметилсульфоксид до концентрации 100 мкг/мл, а затем в буфере № 1 рН 6,8-7,0 (Срок годности растворов при комнатной температуре не более 30 мин)	Candida utilis ЛИА - 01	№16+1% Глюкозы pH 5,8-6,0	29-31
#Линкомицин	Линкомицина гидрохлорида ФСО	Дистиллированная вода	Буфер № 4, pH 7,8-8,0	Bac.subtilis АТСС 6633	№ 8 pH 7,8­8,0	35-37
#Мидекамицин	Мидекамици-на ацетата ФСО	Метиловый спирт до концентрации 500 мкг/мл, а затем буфер 7, рН 4,5	Метиловый спирт до концентрации 500 мкг/мл, а затем буфер 7, рН 4,5	Bac.subtilis АТСС 6633	№ 9, pH 7,8-8,0	35-37
#Метациклин	Метацикли-на гидрохло­рида ФСО	0,01 М раствор хлористоводородной кислоты	Буфер № 2 pH 5,8-6,0	Bac.subtilis, var. Л2	№ 6+1% глюкозы pH 6,8-7,0	30-37
#Метициллин	Метицилли-на натрие­вой соли ФСО	Буфер № 1, pH 6,8-7,0	Буфер № 1, pH 6,8-7,0	Staph^ococcus аureus 209	№ 11, №7+0,1% глюкозы pH 6,8-7,0	35-37
#Микогептин	Микогепти-на ФСО	Диметилсульфоксид	Диметилсульфоксид до 50 мкг/мл,а затем буфер № 4 pH 7,8­8,0 (Срок годности растворов при комнатной температуре не более 30 м)	Candida utilis ЛИА - 01	№16+1% глюкозы pH 5,8-6,0	29-31
#Мономицин	Мономицина ФСО	Дистиллированная вода	3 % раствор хлорида калия	Bac. cereus var. mycoides 537	№ 9 pH 7,8-8,0	35-37
#Неомицин	Неомицина сульфата ФСО	Буфер № 4, pH 7.8-8,0	Буфер № 4, pH 7,8-8,0	Bac. cereus var. mycoides 537	№ 9 pH 7,8-8,0	35-37
Неомицина сульфат	Неомицина сульфата ФСО	Дистиллированная вода	8,0 (0,05 М)	Bacillus pumilus NCTC 8241 CIP 76.18 Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62 ATCC 6633	E; 7.9 E; 7.9	30-37 30-37
#Нистатин	Нистатина ФСО	Диметилформамид	Буфер № 3 pH 6,0-6,2	Candida utilis ЛИА - 01	№ 16+1% глюкозы pH 5,8-6,0	29-31
Нистатин	Нистатина ФСО	Диметилформамид	6,0 (0,05 М) при содержа-нии 5 об.% диметилформамида	Saccharomyce s cerevisiae NCYC 87 CIP 1432-83 ATCC 9763	F; 6.0	30-32
#Оксациллин	Оксациллина натриевой соли ФСО	Буфер № 1, pH 6,8-7,0	Буфер № 1, pH 6,8-7,0	Staphylococcus aureus 209 P	№ 11, № 7+0,1% глюкозы pH 6,8-7,0	35-37
#Окситетра-циклин	Окситетра- циклина гидрохлорида ФСО	0,01 М раствор хлористоводородной кислоты	Буфер № 2 pH 5,8-6,0	Bac.subtilis, var. Л2	№ 6+1% глюкозы pH 6,8-7,0	30-37
#Олеандо-мицин	Олеандо-мицина фос­фата ФСО	Буфер № 3 pH 6,0-6,2	Буфер № 4, pH 7,8-8,0	Bac. cereus var. mycoides НВ	№ 9 pH 7,8-8,0	35-37
#Оливомицин	Оливомицин-кислоты ФСО	Стандартный образец в этиловом спирте из расчета 5 мг в1 мл, затем буфер № 1 pH 6,8-7,0	Буфер № 1, pH 6,8-7,0	Bac.subtilis АТСС 6633	№ 11, № 18 pH 6,8-7,0	35-37
#Полимиксин М	Полимиксина М сульфата ФСО	Буфер № 3 pH 6,0-6,2	Буфер № 5 pH 6,0-6,2	Bo^tella bronchiseptica АТСС 4617	№ 15, pH 7,0-7,2	35-37
#Полимиксин В	Полимиксина В сульфата ФСО	Буфер № 3 pH 6,0-6,2	Буфер № 5 pH 6,0-6,2	Bo^tella bronchiseptica АТСС 4617	№ 15 pH 7,0-7,2	35-37
Полимиксина В сульфат	Полимиксина В сульфата ФСО	Дистиллированная вода	6,0 (0,05 М)	Bordetella bronchiseptica NCTC 8344 CIP 53.157 ATCC 4617	B; 7.3	35-39
#Рифампицин	Рифампицина ФСО	1 мл диметилформамида на 10 мл навески, затем дистиллированная вода	Буфер № 3 pH 6,0-6,2	Bac.subtilis АТСС 6633	№ 10+0,1% глюкозы pH 6,0-6,2	35-37
Рифамицина натриевая соль	Рифамицина натриевой соли ФСО	Метанол	7,0 (0,05 М)	Micrococcus flavus NCTC 8340 CIP 53.45 ATCC 9341	A; 6.6	35-39
#Рубомицин	Рубомицина гидрохлори­да ФСО	Дистиллированная вода	Буфер № 4, pH 6,8-7,0	Bac.cereus var. mycoides 537	№ 5 pH 7,8-8,0	35-37
#Сизомицин	Сизомицина сульфата ФСО	Буфер № 4, pH 6,8-7,0	Буфер № 4, pH 6,8-7,0	Bac. рumilus NCTC 8241	№ 12, № 8 pH 7,8-8,0	35-37
#Стрепто-мицин	Стрептоми­цина суль­фата ФСО	Буфер №3 pH 6,0-6,2	Буфер № 4, pH 6,8-7,0	Bac. cereus var. mycoides 537	№ 9 pH 7,8-8,0	35-37
Стрепто­мицина сульфат	Стрептоми­цина суль­фата ФСО	Дистиллированная вода	8,0 (0,05 М)	Bacillus subtilis NCTC 8236, CIP 1.83. Bacillus subtilis NCTC 10400 CIP 52.62, ATCC 6633	A; 7.9 A; 7.9	30-37 30-37
Спирамицин	Спирамицина ФСО	Метанол	8,0 (0,05 М)	Bacillus subtilis NCTC 10400, CIP 52.62, ATCC 6633	A; 7.9	30-32
#Тетрациклин	Тетрацикли­на гидро-	0,01 М раствор хлористоводородной	Буфер № 2 pH 5,8-6,0	Bac.subtilis, var. Л2	№ 6+1% глюкозы	35-37

В. МЕТОД ТУРБИДИМЕТРИИ

Подходящую питательную среду с суспензией выбранного микроорганизма, обладающего чувствительностью к тестируемому антибиотику, инокулируют таким образом, чтобы в условиях определения происходило достаточно значительное ингибирование микробного роста. Количество суспензии выбирают таким образом, чтобы получить после четырех часов инкубации помутнение, легко подвергающееся количественной оценке.

Инокулированную среду используют немедленно после ее приготовления.

Используя растворитель и буферный раствор, указанные в Таблице 2.7.2.-2, готовят растворы стандартного образца и испытуемого антибиотика, имеющие

известные концентрации и предположительно равные активности. Для оценки достоверности количественного определения используют не менее трех доз стандартного образца и трех доз испытуемого антибиотика. Предпочтительно использовать ряды доз, меняющихся в геометрической прогрессии. Для получения необходимой линейности может оказаться необходимым осуществить выбор из большого количества трех последовательных доз, используя соответствующие дозы для стандартного образца и испытуемого антибиотика.

Помещают равные объемы каждого из растворов в идентичные пробирки и добавляют в каждую пробирку равные объемы инокулированной среды (например, 1 мл раствора и 9 мл среды).

Одновременно готовят две контрольные пробирки без антибиотика, содержащие инокулированную среду. В одну из них немедленно добавляют 0,5 мл формальдегида. Эти пробирки используют для настройки оптического прибора, используемого для измерения роста.

Все пробирки, распределенные случайным образом, методом латинского квадрата или рандомизированного блочного распределения, помещают в водяную баню или в другой подходящий аппарат, позволяющий быстро довести температуру всех пробирок до соответствующей температуры инкубации и поддерживать их при этой температуре в течение 3-4 часов, обеспечивая однородность температурного режима и равное время инкубации.

По окончании инкубации рост микроорганизмов останавливают добавлением 0,5 мл формальдегида в каждую пробирку или тепловой обработкой и измеряют степень мутности, используя подходящий оптический прибор. Можно использовать метод, позволяющий измерять степень мутности в каждой пробирке по окончании одинаковых периодов инкубации.

Измеряют активность с использованием подходящих статистических методов.

Линейность преобразованной или не преобразованной зависимости реакции от дозы часто получается лишь в ограниченном промежутке. Именно в этом промежутке необходимо производить вычисление активности. Для подтверждения линейности определение проводят на трех последовательных дозах из этого промежутка. В рутинных анализах по согласованию с компетентными органами определение может проводиться по двум значениям при условии, что линейность подтверждена адекватным количеством экспериментов с использованием трех значений. Однако, во всех спорных случаях должно применяться вышеописанное определение по трем значениям.

В каждом определении используют достаточное для получения требуемой точности количество репликаций. Определение может быть проведено повторно, и результаты статистически комбинированы для получения требуемой точности и для подтверждения того, что активность испытуемого антибиотика не менее минимальных требований.

				ATCC 6538 P CIP 53.136 ATCC 9144
Фрамицетина сульфат	Фрамицетина сульфата ФСО	Дистиллированная вода	8,0	Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538 P	C; 7.0	35-37
Эритромицина эстолат		Метанол (см. частные статьи) Метанол		Klebsiella pneumoniae NCTC 7427 CIP 53.153	D; 7.0	35-37
Эритромицина этилсукцинат Эритромицина стеарат	Эритромици­на ФСО		8,0	ATCC 10031 Staphylococcus aureus NCTC 7447 CIP 53.156 ATCC 6538 P	C; 7.0	35-37

Следующий раздел дается для информационных и методических целей; он не является обязательной частью общего метода.

РЕКОМЕНДУЕМЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ

В нижеследующем тексте приводятся рекомендуемые микроорганизмы и условия их применения. Могут также использоваться и другие микроорганизмы при условии, что показана их чувствительность к испытуемому антибиотику и они могут использоваться в подходящей среде и при подходящих значениях температуры и рН. Концентрации используемых растворов должны быть выбраны таким образом, чтобы в условиях испытания обеспечивалось наличие линейной зависимости между логарифмом дозы и реакцией.

Приготовление посевного материала:

Bacillus cereus var. mycoides; Bacillus subtilis; Bacillus pumilus. Суспензия спор микроорганизмов, используемая в качестве посевного материала, готовится следующим образом.

Микроорганизм выращивается при 35-37°С в течение 7 дней на поверхности подходящей среды, к которой добавлен сульфат марганца (II) в концентрации 0,001 г/л. Выращенную культуру, состоящую в основном из спор, смывают стерильной водой. Нагревают суспензию при 70 °С 30 минут и разбавляют для получения подходящей концентрации спор, обычно от 10 х 10⁶ до 100 х 10⁶ в мл. Суспензия спор может храниться в течение продолжительного времени при температуре, не превышающей 4°С.

Суспензия спор также может быть приготовлена путем культивирования организмов в среде С при 26°С в течение 4-6 дней с последующим добавлением в асептических условиях сульфата марганца в количестве, достаточном для получения концентрации 0,001 г/л и инкубированием в течение 48 часов. Суспензию микроскопируют для подтверждения спорообразования (около 80%) и центрифугируют. Осадок ресуспендируют в стерильной воде, получая концентрацию спор от 10 х 10⁶ до 100 х 10⁶ в миллилитре, после чего нагревают при 70°С в течение 30 минут. Суспензию хранят при температуре, не превышающей 4°С.

Bordetella bronchiseptica. Микрорганизм выращивают на среде В при 35-37°С в течение 16-18 ч. Выращенную культуру смывают стерильной водой и разбавляют до требуемой степени мутности.

Staphylococcus aureus; Klebsiella pneumoniae; Escherichia coli; Micrococcus flavus; Staphylococcus epidermidis. Посевной материал готовят по методу, описанному выше для В. bronchiseptica, но с использованием среды А и доведением степени мутности до значения, дающего, в зависимости от метода, удовлетворительную зависимость реакции от дозы в турбидиметрическом определении или четкие зоны ингибирования подходящего диаметра.

Saccharomyces cerevisiae; Candida tropicalis. Тест-культуры выращивают на среде F при 30-37°С 24 часа. Смывают выращенную культуру стерильным раствором натрия хлорида с концентрацией 9 г/л. Разбавляют до требуемой степени мутности тем же раствором.

# Допустимо использование следующих методов приготовления посевного материала:

Candida utilis ЛИА-01

Выращивают в пробирках со скошенной средой № 3 в течение 48 часов при температуре (30 ± 1)°С.

Staphylococcus aureus

Выращивают в пробирках со скошенной средой № 1 в течение 24 часов при температуре (36 ± 1)°С.

Bordetella bronchiseptica

Выращивают в пробирках со скошенной средой № 1. Продолжительность инкубации 30-36 часов при температуре (36 ± 1)°С.

Pseudomonas aeruginosa NCTC 2134

Выращивают на мясо-пептонном бульоне рН 7,2-7,4 при температуре (36 ± 1 )°С в течение 18-20 часов.

Bacillus pumilus, NCTC 8241, Bacillus subtilis ATCC 6633, Bacillus cereus var.mycoides HB, Bacillus cereus var.mycoides 537

Для получения суспензии спор тест-микроорганизмы выращивают на скошенной среде в пробирках (среда № 1 для В. subtilis var.L₂, B.pumilus NCTC8241, В. subtilis ATCC 6633, B.cereus var.mycoides HB; среда № 2 для B.cereus var.mycoides 537), при температуре (36 ± 1)°C 18-20 часов. Культуру, выращенную в пробирках, смывают 5-10 мл стерильного раствора натрия хлорида 0,9 %, засевают ею несколько матрацев с 300 мл питательной среды со скошенной поверхностью, (среда № 4 для B.pumilus, В. cereus var.mycoides 537; среда № 5 для В. subtilis ATCC 6633, B.cereus var.mycoides HB). На матрацах посевы инкубируют при температуре (36 ± 1 )°С в течение 5-7 суток. В процессе выращивания проводят микроскопический контроль культуры. Культуру, содержащую 80-90 % спор, смывают стерильной дистиллированной водой.

Полученную взвесь спор прогревают при температуре от 60 до 70°С в течение 30 минут. Затем промывают стерильной дистиллированной водой при центрифугировании до полной прозрачности надосадочной жидкости. Промытую взвесь спор вновь прогревают в течение 30 минут при температуре от 60 до 70°С. Взвесь спор хранят при температуре от 4 до 10°С и используют до тех пор, пока

интенсивность роста и четкость зон при определении антимикробной активности препаратов удовлетворяют предъявляемым требованиям.

Bordetella bronchiseptica ATCC 4617	МПА. рН 7.2—7.4 Т0 (36-±1) 0С. 18—20 ч	Мелкие, мутные, белые слегка выпуклые фарфоровидные колонии	МПБ. рН 7.2—7.4	Заметное помутнение, серая пленка, тягучий осадок
Pseudomonas aeruginosa NCTC 2134	МПА. рН 7.2—7.4. Т0(36±1)0С. 18—20 ч	Широкие расплывчатые прозрачные с неровным краем колонии	МПБ. рН 7.2—7.4	Заметное помутнение, толстая пленка, среда может приобретать желтовато-зеленую окраску

Одиночные, короткие,
тонкие палочки с
хорошо выраженной
грамотрицательной
окраской

Одиночные палочки, либо короткие цепочки с хорошо выраженной грамотрицательной окраской

| оелену!ю окраску |

Буферные растворы. Буферные растворы с показателем рН в интервале от 5,8 до 8,0 готовят смешиванием 50,0 мл 0,2 М раствора калия фосфата однозамещенного с указанным в Таблице 2.7.2.-4 объемом 0,2 М раствора натрия гидроксида. Разбавляют свежеприготовленной дистиллированной водой до 200,0 мл.

Эти буферные растворы используются для всех микробиологических определений, указанных в Таблице 2.7.2.-1, за исключением блеомицина сульфата и амфотерицина В.

Буферный раствор (рН 6,8) для блеомицина сульфата готовят растворением 6,4 г калия фосфата однозамещенного и 18,9 г натрия фосфата двузамещенного в воде и доведением объема до 1000 мл.

# Допускается также применение буферных растворов следующего состава:

Буфер № 1 Состав:

Калия фосфат однозамещенный 3 , 6 3 г

Натрия фосфат двузамещенный 7,13 г

Вода дистиллированная д о 1 000 м л

рН буфера 6 , 9 ±0 , 1

Буфер № 2 Состав:

Натрия цитрат трехзамещенный 2 0 , 6 г

Кислота хлористоводородная концентрированная 1,81 г

Вода дистиллированная до 1000 мл

рН буфера 5,9±0,1

Буфер № 3 Состав:

Калия фосфат однозамещенный 7 , 72 г

Натрия фосфат двузамещенный 1,78 г

Вода дистиллированная д о 1 000 м л

рН буфера 6 , 1 ±0 , 1

Буфер № 4 Состав:

Калия фосфат однозамещенный 0 , 6 8 г

Натрия фосфат двузамещенный 10,99 г

Вода дистиллированная д о 1 000 м л

рН буфера 7 , 9 ±0 , 1 6

Буфер № 5 Состав:

Калия фосфат однозамещенный 32 г

Натрия фосфат двузамещенный 8 г

Вода дистиллированная д о 1 000 м л

рН буфера 6 , 1 ±0 , 1

Буфер № 6 Состав:

Натрия фосфат двузамещенный 35,8 г

Вода дистиллированная д о 1 000 м л

рН буфера 6 , 0

Буфер № 7 Состав:

Натрия фосфат однозамещенный 0 , 64 г

Натрия фосфат двузамещенный 0,195 г

Вода дистиллированная д о 1 000 м л

рН буфера 4 , 5

Буферные растворы стерилизуют насыщенным паром под давлением при 121°С 15 минут.

Питательные среды. Могут быть использованы следующие или эквивалентные питательные среды.

Среда А.

Пептон 6г

Панкреатический гидролизат казеина 4г

Мясной экстракт 1,5 г

Дрожжевой экстракт 3 г

Глюкозы моногидрат 1 г

Агар 15 г

Вода до 1000 мл

Среда В

Панкреатический гидролизат казеина 17 г

Папаиновый гидролизат соевых бобов 3 г

Натрия хлорид 5 г

Калия фосфат двузамещенный 2,5 г

Глюкозы моногидрат 2,5 г

Агар 15 г

Полисорбат80 10 г

Вода до 1000 мл

Полисорбат 80 добавляется к горячему раствору остальных ингредиентов после кипячения, непосредственно перед доведением объема.

Среда С.

Пептон 6г

Мясной экстракт 1,5 г

Дрожжевой экстракт 3 г

Натрия хлорид 3,5 г

Глюкозы моногидрат 1 г

Калия фосфат двузамещенный 3,68 г

Калия фосфат однозамещенный 1,32 г

Вода до 1000 мл

Среда D.

Экстракт сердца 1,5 г

Дрожжевой экстракт 1,5 г

Пептон-казеин 5 г

Глюкозы моногидрат 1 г

Натрия хлорид 3,5 г

Калия фосфат двузамещенный 3,68 г

Калия фосфат однозамещенный 1,32 г

Калия нитрат 2 г

Вода до 1000 мл

Среда Е.

Пептон 5 г

Мясной экстракт 3 г

Натрия фосфат двузамещенный двенадцативодный 26,9 г

Агар 10 г

Вода до 1000 мл

Натрия фосфат двузамещенный добавляется в виде стерильного раствора после стерилизации среды.

Среда F.

Пептон 9,4 г

Дрожжевой экстракт 4,7 г

Мясной экстракт 2,4 г

Натрия хлорид 30,0 г

Глюкозы моногидрат 1 0 , 0 г

Агар 23,5 г

Вода до 1000 мл

Среда G.

Глицерин 10 г

Пептон 10 г

Мясной экстракт 10 г

Натрия хлорид 3 г

Агар 15 г

Вода до 1000 мл рН 7,0+0,1 после стерилизации

#

Среда № 1

Состав:

Мясо-пептонный бульон 1000 мл

Агар-агар 2 0 г

рН после стерилизации 7 , 1 ±0 , 1

Среда № 2 Состав:

Мясо-пептонный бульон 1000 мл

Агар-агар 2 0 г

рН после стерилизации 7 , 9 ±0 , 1

Среда № 3 Состав:

Мясо-пептонный бульон 1000 м л

Агар-агар 17 г

Глюкоза 10 г

Натрия хлорид 5г

рН после стерилизации 7 , 1±0 , 1

Среда № 4 Состав:

Раствор гидролизата мяса по Хоттингеру с содержанием 1000 мл аминного азота 35-40% мг %

Агар-агар 2 5 г

рН после стерилизации 6 , 1±0 , 1

Среда № 5 Состав:

Раствор гидролизата мяса по Хоттингеру с содержанием 1000 мл аминного азота 35-40% мг %

Агар-агар 2 5 г

рН после стерилизации 7 , 9 ±0 , 1

Среда № 6 Состав:

Раствор гидролизата мяса по Хоттингеру с содержанием 1000 мл аминного азота 130-140% мг %

Агар-агар 1 0 - 15 г

рН после стерилизации 6 , 9 ±0 , 1

Среда № 7 Состав:

Раствор гидролизата мяса по Хоттингеру с содержанием 1000 мл аминного азота 130-140% мг %

Агар-агар 10-12 г

Натрия фосфат двузамещенный 3 г

рН после стерилизации 6,9±0,1

Среда № 8 Состав:

Раствор гидролизата мяса по Хоттингеру с содержанием 1000 мл аминного азота 130-140% мг %

Агар-агар 10-12 г

Натрия фосфат двузамещенный 3 г

рН после стерилизации 7 , 9 ±0 , 1

Среда № 9 Состав:

Раствор гидролизата мяса по Хоттингеру с содержанием 1000 мл аминного азота 35-40% мг %

Натрия фосфат двузамещенный 3 г

рН после стерилизации 7 , 9 ±0 , 1

Среда № 10 Состав:

Раствор гидролизата мяса по Хоттингеру с содержанием 1000 мл аминного азота 130-140% мг %

Агар-агар 10-15 г

Калия фосфат однозамещенный 25 г

рН после стерилизации 6 , 1 ±0 , 1

Среда № 11 Состав:

Агар-агар 10-15 г

Натрия фосфат двузамещенный 3 г

Вода дистиллированная д о 1 000 м л

рН после стерилизации 6,9 ±0,1

Среда № 12 Состав:

Агар-агар 1 5 г

Натрия фосфат двузамещенный 3 г

Вода дистиллированная д о 1 000 м л

рН после стерилизации 7 , 9± 1

Среда № 13 Состав:

Раствор гидролизата мяса по Хоттингеру с содержанием 1000 мл аминного азота 35-40% мг %

Агар-агар 20 г

Калия хлорид 20 г

рН после стерилизации 7 , 1± 1

Среда № 14 Состав:

Раствор гидролизата мяса по Хоттингеру с содержанием 1000 мл аминного азота 35-40% мг %

Агар-агар 15 г

рН после стерилизации 7 , 9± 1

Среда № 15 Состав:

Раствор гидролизата мяса по Хоттингеру с содержанием 1000 мл аминного азота 35-40% мг %

Агар-агар 15г

Калия фосфат однозамещенный 25 г

рН после стерилизации 7 , 1± , 0 , 1

Среда № 16 Состав:

Агар-агар 1 8 -20 г

Натрия фосфат двузамещенный 5г

Натрия хлорид 20

Аммония цитрат двузамещенный 5 г

Калия хлорид 20 г

Вода дистиллированная до 1000 мл

рН после стерилизации 5 , 9 ± , 0 , 1

Среда № 17 Состав:

Агар-агар 1 8 г

Глюкоза 5 г

Натрия фосфат двузамещенный 15 г

Мочевина 2г

Аммония хлорид 2г

Вода дистиллированная до 1000 мл

рН после стерилизации 7,9±1

Среда № 18 Состав:

Раствор гидролизата мяса по Хоттингеру с содержанием 1000 мл аминного азота 130-140% мг %

Агар-агар 15-20 г

Глюкоза 5 г

Натрия хлорид 30 г

рН после стерилизации 6 , 9± 1

Среды стерилизуют насыщенным паром под давлением при 121°С 15 минут.

При приготовлении питательных сред вместо раствора гидролизата мяса по Хоттингеру можно использовать питательные среды на основе рыбного или мясо-пептонного бульона с таким же содержанием аминного азота

Среды стерилизуют в паровом стерилизаторе при температуре 121 °С в течение 15 минут.