2.6.12. Микробиологические испытания несте­рильной продукции (суммарное количество жизнеспособных аэробов)

Испытания, описанные ниже, позволяют осуществлять количественное оп­ределение мезофильных бактерий и грибов, способных расти в аэробных услови­ях.

Испытания предназначены прежде всего для того, чтобы определить, соот­ветствует ли субстанция требованиям микробиологической чистоты, приведенным в частной статье. Если испытания проводят с этой целью, выполняют требования, изложенные ниже, включая количество образцов, отбираемых для анализа, и ин­терпретацию полученных результатов. Приведенные ниже методики могут быть также использованы при испытании эффективности антимикробных консервантов (5.1.3), в соответствии с Фармакопеей. Кроме того, их можно использовать при оп­ределении качества сырья и готовых лекарственных средств в соответствии с ре­комендациями, изложенными в статье «Микробиологическая чистота лекарст­венных средств» (5.1.4). В этом случае, например, при определении производи­телем качества сырья и/или готовых лекарственных средств или при проведении проверки пригодности выбранной методики порядок проведения исследования, в том числе количество образцов, отбираемых для анализа, и интерпретацию полу­ченных результатов производитель устанавливает при согласовании с компетент­ным уполномоченным органом.

Выполняют испытания в условиях, позволяющих избежать случайной кон­таминации испытуемого продукта. Меры предосторожности, предпринимаемые для предотвращения контаминации, не должны влиять ни на один из микроорга­низмов, обнаруживаемых в ходе испытания. Если испытуемый продукт обладает антимикробной активностью, она должна быть подходящим образом нейтрализо­вана. Если для этой цели используют инактиваторы, должна быть продемонстри­рована их эффективность и нетоксичность в отношении микроорганизмов.

• Если всвязи с природой лекарственного средства нельзя использовать метод мембранной фильтрации, а все вышеперечисленные методы устранения его антимикробного действия в отношении данного тест-штамма не эффективны, этот вид испытания не проводят.

Суммарное количество жизнеспособных аэробов определяют методом мембранной фильтрации, чашечным методом подсчета или методом последова­тельных разведений, в соответствии с указаниями в частной статье.

• Допускается использование автоматизированных методов испытаний.

Метод наиболее вероятного числа предназначен для использования в тех случаях, когда другие методы использовать невозможно. При выборе метода ис­пытания необходимо учитывать природу испытуемого лекарственного средства и ожидаемое количество микроорганизмов. Необходимо надлежащим образом про­вести проверку пригодности выбранной методики.

Если испытание проводится в соответствии с разделом 5.1.3 или 5.1.4, сле­дует использовать методы глубинного, поверхностного, двухслойного высева на чашки Петри или метод мембранной фильтрации.

ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦА

Порядок отбора проб. Отбор проб лекарственного средства необходимо проводить в строго определенном порядке. Порядок отбора проб зависит от объ­ема серии, степени опасности для здоровья, связанной с микробным загрязнени­ем лекарственного средства выше допустимого уровня, характеристиками лекар­ственного средства и ожидаемым уровнем микробного загрязнения. Если нет дру­гих указаний в частной статье, для испытания используют образцы по 1° г или 1° мл субстанции или лекарственного средства, отобранные с вышеупомянутыми мерами предосторожности. Образец (образцы) отбирают случайным образом из массы испытуемого материала или из контейнеров с лекарственным средством. Для отбора средней пробы, при необходимости, смешивают содержимое доста­точного количества контейнеров для получения образца необходимой массы или объема, в зависимости от природы испытуемой субстанции или препарата.

Примером плана отбора проб является трехуровневый порядок пробоотбо-ра, используемый для лекарственных средств с большой вероятностью неравно­мерного распределения микроорганизмов. Этот план предусматривает отбор от каждой серии пяти образцов, каждый из которых испытывают отдельно. При этом допускают, что в результате исследования могут быть выявлены образцы, харак­теризующиеся тремя уровнями микробного загрязнения: (i) - соответствующие образцы, содержащие меньше m колониеобразующих единиц (КОЕ) в грамме или миллилитре, где m - предельно допустимое количество микроорганизмов, уста­новленное соответствующей частной статьей; (ii) - граничные образцы, содержа­щие в грамме или миллилитре больше m, но меньше 1°m КОЕ; (iii) - бракованные образцы, содержащие больше 1°m КОЕ в грамме или миллилитре.

Водорастворимые продукты. 1° г или 1° мл испытуемого продукта рас­творяют в буферизированном растворе хлорида натрия и пептона рН 7,° или дру­гой подходящей жидкости. Обычно готовят разведение в соотношении 1:1°. Одна­ко характеристики некоторых продуктов или требуемая чувствительность могут обусловить необходимость использования других соотношений. Если известно, что продукт обладает антимикробной активностью, к растворителю может быть добавлен инактивирующий агент. При необходимости доводят значение рН при­близительно до 7 и готовят серийные десятикратные разведения с использовани­ем того же растворителя.

Нерастворимые в воде продукты, не относящиеся к жирам. 1° г или 1°

мл испытуемого продукта суспендируют в буферизированом растворе хлорида натрия и пептона рН 7,° или в другой подходящей жидкости. Обычно готовят раз­ведение в соотношении 1:1°, но характеристики некоторых продуктов могут обу­словить необходимость использования больших объемов. Для облегчения сус-пендирования плохо смачиваемых субстанций может быть добавлен подходящий поверхностно-активный компонент, например, полисорбат 8° в количестве 1 г/л. Если известно, что продукт обладает антимикробной активностью, к растворителю может быть добавлен инактивирующий агент. При необходимости доводят значе­ние рН приблизительно до 7 и готовят серийные десятикратные разведения с ис­пользованием того же растворителя.

Жиры. 1° г или 1° мл испытуемого продукта гомогенизируют с полисорба-том 8° или с другим подходящим стерильным поверхностно-активным агентом, взятым в количестве, не превышающем половины массы испытуемого образца, и при необходимости нагретым до температуры, не превышающей 4°°С, в исключи­тельных случаях - 45°С. Осторожно перемешивают, при необходимости поддер­живая температуру с помощью водяной бани или инкубатора. Добавляют предва­рительно нагретый буферизированный раствор хлорида натрия и пептона рН 7,° в количестве, достаточном для получения разведения исходного продукта в соот­ношении 1:1°. Осторожно перемешивают, поддерживая температуру в течение минимального промежутка времени, необходимого для образования эмульсии, и в любом случае не превышающего 3° минут. Дальнейшие серийные десятикратные разведения могут быть приготовлены с использованием буферизированного рас­твора хлорида натрия и пептона рН 7,°, содержащего стерильный полисорбат 8° или другой стерильный поверхностно-активный агент в подходящей концентра­ции.

Трансдермальные пластыри. Десять пластырей освобождают от защит­ного покрытия с помощью стерильного пинцета и помещают в стерильные пласт­массовые или стеклянные лотки клейкой поверхностью вверх. При необходимости клейкую поверхность накрывают стерильной марлей или сеткой из полимерного моноволокна типа тканого фильтра и переносят 1° пластырей в емкость, вме­щающую не менее 5°° мл буферизированного раствора хлорида натрия и пепто­на рН 7,°, содержащего подходящий инактиватор, например, полисорбат 8° или лецитин. Энергично встряхивают не менее 3° минут (образец А). Другую группу из 1° пластырей готовят аналогичным образом и помещают в емкость, содержащую не менее 5°° мл жидкой питательной среды D, и энергично встряхивают не ме­нее 3° минут (образец B).

ИСПЫТАНИЕ ОБРАЗЦА

Мембранная фильтрация. Используют мембранные фильтры с номиналь­ным размером пор, не превышающим °,45 мкм, с установленной способностью к удерживанию бактерий. Тип фильтрующего материала выбирают таким образом, чтобы компоненты испытуемого образца не влияли на эффективность удержива­ния бактерий. Например, фильтры на основе нитрата целлюлозы используют для водных, масляных и разбавленных спиртовых растворов, а фильтры на основе ацетата целлюлозы - в частности, для растворов с высоким содержанием спирта. Конструкция аппарата для фильтрования должна обеспечивать перенос фильтра на питательную среду.

Подходящее количество образца, приготовленного в соответствии с указа­ниями раздела «Подготовка образца» (предпочтительно, соответствующее 1 г продукта, или меньшему количеству, если ожидается наличие большого числа ко-лониеобразующих единиц), наносят на каждый из двух мембранных фильтров и немедленно фильтруют. Каждый фильтр промывают тремя порциями, приблизи­тельно по 1°° мл каждая, подходящей жидкости, например, буферизированного раствора хлорида натрия и пептона рН 7,°. К этому раствору могут быть добавле­ны поверхностно активные агенты, например, полисорбат-8°, или инактиваторы антимикробных компонентов. Допускается проведение менее трех промывок, при условии проведения проверки пригодности такой методики. Один из мембранных фильтров, предназначенный преимущественно для подсчета бактерий, переносят на поверхность чашки с подходящей агаризованной средой, например, агаризо-ванной средой В # или средой №1, а другой, предназначенный преимущественно для подсчета грибов, - на поверхность чашки с подходящей агаризованной сре­дой, например, агаризованной средой С # или средой №2. Чашку с агаризованной средой В (# средой №1) инкубируют при температуре от 3°^°С до35^°С, а чашку с агаризованной средой С (# средой №2) - при температуре от 2°^°С до 25^°С в тече­ние 5 дней, если за более короткое время не могут быть получены достоверные результаты. Выбирают чашки с максимальным количеством колоний менее 1°° и вычисляют количество колониеобразующих единиц в грамме или миллилитре ис­пытуемого продукта.

При испытании трансдермальных пластырей 5° мл образца А фильтруют по отдельности через каждый из двух стерильных мембранных фильтров. Одну мем­брану помещают на агаризованную среду В # или среду №1 для определения об­щего числа аэробов, а другую мембрану - на агаризованную среду С # или среду №2 для подсчета грибов.

МЕТОДЫ ЧАШЕЧНОГО ПОДСЧЕТА

1. Метод глубинного посева. Используют чашки Петри диаметром 9 см. В каждую чашку помещают 1 мл образца, подготовленного в соответствии с указа­ниями раздела «Подготовка образца», и 15-2° мл расплавленной агаризованной среды, подходящей для культивирования бактерий (например, среды В или среды №1) или 15-2° мл расплавленной агаризованной среды, подходящей для культи­вирования грибов (например, среды С или среды №2), при температуре, не пре­вышающей 45^°С. Если используются чашки Петри большего размера, то соответ­ственно увеличивают количество агара. Готовят для каждой среды не менее двух чашек с каждым из разведений. Чашки инкубируют при температуре от 3°^°С до 35^°С (от 2°^°С до 25^°С для грибов) в течение 5 дней, если за более короткое время не могут быть получены достоверные результаты. Выбирают чашки, соответст­вующие одному разведению, на которых максимальное число колоний менее 3°° (1°° для грибов). Вычисляют среднее арифметическое значение числа колоний и определяют количество колониеобразующих единиц в грамме или миллилитре.

2. Метод поверхностного посева. Используют чашки Петри диаметром 9 см. В каждую чашку помещают 15-2° мл расплавленной агаризованной среды, подходящей для культивирования бактерий (например, среды В или среды №1) или 15-2° мл расплавленной агаризованной среды, подходящей для культивиро­вания грибов (например, среды С или среды №2), при температуре около 45^°С и дают среде застыть. Если используются чашки Петри большего размера, то соот­ветственно увеличивают количество агара. Чашки сушат, например, в условиях ламинарного потока воздуха или в инкубаторе. Отмеренный объем образца, под­готовленного в соответствии с указаниями раздела «Подготовка образца», со­ставляющий не менее °,1 мл, распределяют по поверхности среды. Готовят для каждой среды не менее двух чашек с каждым из разведений. Инкубацию и под­счет количества колониеобразующих единиц производят в соответствии с выше­приведенными указаниями для метода глубинного высевания.

# Двухслойный агаровый метод. 1 мл подготовленного продукта вносят в две пробирки с 4 мл расплавленной и охлажденной до 45^°С среды №1 (для опре­деления количества бактерий). Содержимое пробирки быстро перемешивают, пе­реносят в чашку Петри, содержащую 15-2° мл застывшей питательной среды №1, и равномерно распределяют по поверхности. Для количественного определения грибов поступают аналогичным способом, используя среду №2. Инкубирование посевов, подсчет колоний бактерий и грибов выполняют, как описано выше.

МЕТОД НАИБОЛЕЕ ВЕРОЯТНОГО ЧИСЛА

Метод наиболее вероятного числа (НВЧ) уступает по точности методам мембранной фильтрации и чашечного подсчета. Особенно недостоверными яв­ляются результаты подсчета плесневых грибов. Поэтому метод НВЧ следует при­менять лишь для подсчета бактерий в тех случаях, когда другие методы недос­тупны. Если применение данного метода обосновано, определение проводят в соответствии с нижеследующими указаниями.

Готовят ряд не менее, чем из трех последовательных десятикратных раз­ведений продукта, в соответствии с указаниями раздела «Подготовка образца». Для каждого уровня разведения используют три аликвоты по 1 г или 1 мл для ино­

куляции трех пробирок, содержащих от 9 до 10 мл подходящей жидкой питатель­ной среды (например, питательной среды А). При необходимости, к среде могут быть добавлены поверхностно-активные агенты (например, полисорбат 80) или инактиваторы антимикробных компонентов. Таким образом, для трех уровней разведения готовят для инокуляции девять пробирок. Все пробирки инкубируют при температуре от 30⁰С до 35⁰С в течение 5 дней. Для каждого уровня разведе­ния записывают количество пробирок, в которых наблюдается микробный рост. Если природа испытуемого продукта приводит к получению неопределенных или трудно оцениваемых результатов, производят пересев на ту же жидкую среду или на подходящую агаризованную среду (например, агаризованную среду В), инкуби­руют при той же температуре от 18 до 24 часов и для подсчета используют полу­ченные результаты. Наиболее вероятное количество микроорганизмов в грамме или миллилитре испытуемого продукта определяют по Таблице 2.6.12.-1.

Таблица 2.6.12.-1

Наиболее вероятное число микроорганизмов Три пробирки для каждого уровня разведения

Категория*

НВЧ

в 1 г

Пределы 95% до­верительного ин­тервала

Количество пробирок с на­блюдаемым ростом микроор-

0,1 г	0,01 г	0,001 г		1	2
0	0	0	< 3			-	-
0	1	0	3		X	< 1	17
1	0	0	3	X		1	21
1	0	1	7		X	2	27
1	1	0	7	X		2	28
1	2	0	11		X	4	35
2	0	0	9	X		2	38
2	0	1	14		X	5	48
2	1	0	15	X		5	50
2	1	1	20		X	8	61
2	2	0	21	X		8	63
3	0	0	23	X		7	129
3	0	1	38	X		10	180
3	1	0	43	X		20	210
3	1	1	75	X		20	280
3	2	0	93	X		30	390
3	2	1	150	X		50	510
3	2	2	210		X	80	640
3	3	0	240	X		100	1400
3	3	1	460	X		200	2400
3	3	2	1100	X		300	4800
3	3	3	> 1100			-	-

* Категория 1: Нормальные результаты, получаемые в 95% случаев.

Категория 2: Менее вероятные результаты, получаемые только в 4% случаев. Их не следует использовать при принятии важных решений. Результаты, еще ме­нее вероятные, чем относящиеся к категории 2, не приводятся и всегда являются

неприемлемыми.

РОСТОВЫЕ СВОЙСТВА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД И ПРОВЕРКА ПРИГОДНОСТИ МЕТОДИКИ ИСПЫТАНИЯ

В контейнерах с подходящей жидкой питательной средой (например, с пи­тательным бульоном А) выращивают по отдельности бактериальные тест-культуры при температуре от 30⁰С до 35⁰С в течение 18-24 часов. На подходящих агаризованных средах (например, на среде С без антибиотиков # или среде №2) выращивают по отдельности тест-культуры грибов. Candida albicans, инкубируют при температуре от 20⁰С до 25⁰С в течение 48 часов, а Aspergillus niger - при тем­пературе от 20⁰С до 25⁰С в течение 7 дней.

Staphylococcus aureus например,

• или

Escherichia coli например,

• или

Bacillus subtilis например, Candida albicans например,

• или

Aspergillus niger например,

• или

АТСС 6538 (NCIMB 9518, CIP 4.83) ATCC 6538 P

ATCC 8739 (NCIMB 8545, CIP 53.126)

АТСС 25922

ATCC 6633 (NCIMB 8054, CIP 52.62)

ATCC 10231 (NCPF 3179, IP 48.72),

АТСС 885-653

ATCC 16404 (IMI 149007, IP 1431.83)

ВКМ F-1119

Порции каждой из культур разбавляют буферизированным раствором хло­рида натрия и пептона рН 7,0, получая тест-суспензии, содержащие около 100 жизнеспособных микроорганизмов в миллилитре. Используют суспензию каждого из микроорганизмов по отдельности в качестве контроля методов подсчета в при­сутствии и отсутствии испытуемого продукта. При проверке метода мембранной фильтрации или чашечного подсчета результат подсчета для каждого из тест-штаммов не должен отличаться более, чем в пять раз, от значения, вычисленного для посевного материала. При проверке метода наиболее вероятного числа зна­чение, вычисленное для посевного материала, должно находиться в пределах 95% доверительного интервала для полученных результатов. Для проверки сте­рильности среды и растворителя, а также контроля условий асептики при прове­дении испытания, выполняют определение тем же методом с использованием в качестве испытуемого препарата стерильного буферизированного раствора хло­рида натрия и пептона рН 7,0. Роста микроорганизмов наблюдаться не должно.

# Тест-культуры бактерий можно выращивать на скошенной в пробирках плотной питательной среде подходящего состава, например, среде №1. Для по­лучения тест-суспензии выращенные в пробирках культуры смывают раствором натрия хлорида 0,9% и разводят этим же раствором до нужного содержания кле­ток в миллилитре.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

За общее число бактерий принимают среднее количество колониеобра-зующих единиц, обнаруженных на агаризованной среде В # или среде №1. За об­щее число грибов принимают среднее количество колониеобразующих единиц, обнаруженных на агаризованной среде С # или среде №2. Суммарное количество жизнеспособных аэробов представляет собой сумму числа бактерий и числа гри­бов, определенных выше. Если имеются доказательства роста на обеих средах микроорганизмов одинаковых типов, могут быть внесены соответствующие по­правки. Если подсчет выполнен методом наиболее вероятного числа, то вычис­ленное значение представляет собой количество бактерий.

При использовании трехуровневого плана отбора проб поступают следую­щим образом.

Определяют общее число микроорганизмов отдельно для каждого из пяти образцов. Считают, что субстанция или готовое лекарственное средство удовле­творяет требованиям по микробиологической чистоте, если выполняются сле­дующие условия:

1. - общее число микроорганизмов, определенное для каждого испытуемо­го образца, не превышает допустимый уровень больше чем в 10 раз (отсутствуют бракованные образцы),

2. - не более чем для двух испытуемых образцов общее число микроорга­низмов, определенное в результате испытания, находится в интервале между до­пустимым уровнем и десятикратным значением (то есть не более двух предель­ных образцов).

Использование трехуровневого плана отбора проб должно быть предусмот­рено в частной статье.

Если в частной статье предписано максимальное значение, оно должно ин­терпретироваться следующим образом:

10² микроорганизмов - максимально допустимое значение: 5х10²;

10³ микроорганизмов - максимально допустимое значение: 5х10³; и т.д.

• Если при испытании образца методом мембранной фильтрации при раз­ведении лекарственного средства 1:10 не выявлен рост микроорганизмов на мем­бранных фильтрах, результаты выражают следующим образом: «В 1 г (мл) лекар­ственного средства (сырья) бактерии (грибы) не выявлены».

• В том случае, если при испытании образца методом высева на чашки при разведении лекарственного средства 1:10 не выявлен рост микроорганизмов на чашках, результаты отмечают следующим образом: «В 1 г (мл) лекарственного средства (сырья) менее 10 бактерий».

• Если в частной статье приведены допустимые пределы содержания мик­роорганизмов, результаты интерпретируют следующим образом:

10² микроорганизмов - максимально допустимое значение: 1 х10²;

10³ микроорганизмов - максимально допустимое значение: 1 х10³; и т.д. Рекомендуемые растворы и питательные среды описаны в общем разделе 2.6.13.