2.6.6. Испытание на посторонние агенты с ис­пользованием цыплят.

Если в частной статье нет иных указаний, испытание проводят не менее, чем на 10 цыплятах двухнедельного возраста, отобранных из групп, не содержа­щих специфических патогенов. Каждому из цыплят делают прививку в количестве 100 доз внутримышечно и 10 доз путем закапывания в глаза. Через две недели прививки повторяют. Птиц наблюдают в течение пяти недель со дня первой при­вивки. В течение периода наблюдения птицам не вводятся антимикробные аген­ты.

Проводят отбор сыворотки у каждого из цыплят перед первой прививкой и в конце испытания. Каждую из сывороток исследуют соответствующим методом. Определяют наличие антител против нижеперечисленных инфекционных агентов, за исключением антител против вируса, из которого была изготовлена вакцина. Вакцина не выдерживает испытания при наличии любых доказательств присутст­вия посторонних агентов. Результаты испытания недостоверны при обнаружении любых антител до прививки. В таком случае испытание повторяют. Результаты испытания также недостоверны, если к его концу выживает менее 80% животных. По согласованию с компетентными органами могут применяться и другие методы испытания при условии их соответствующей специфичности и чувствительности, не меньшей по сравнению с чувствительностью нижеуказанных методов.

Тип испытания

Агаровый гель - преципитин

или ингибирование гемагглютинации

Агаровый гель - преципитин

Агаровый гель - преципитин Ингибирование гемагглютинации Агглютинация

Агаровый гель - преципитин Агаровый гель - преципитин или твердофазное иммуноферментное опреде­ление (ELISA)

Агаровый гель - преципитин Нейтрализация сыворотки

Агаровый гель - преципитин Нейтрализация сыворотки

Инфекция

Инфекционный бронхит⁽¹⁾

Инфекционный бурсит (болезнь Гумборо) Болезнь Марека Болезнь Ньюкасла Инфекции , вызываемые Salmo­nella pullorum

Аденовирусные инфекции⁽²⁾ Инфекции, вызываемые виру­сом птичьей энцефалопатии

Реовирусные инфекции ⁽²⁾ Инфекции, вызываемые виру­сом лейкоза⁽²⁾ Грипп А⁽²⁾

Инфекционный ларинготрахе-

ит^(2Т

⁽¹⁾ По согласованию с компетентными органами, при рутинных испытаниях партий продукции данное испытание может не выполняться, если для каждой партии вы- полнено испытание на посторонние вирусы с использованием оплодотворенных яиц (2.6.3).

⁽²⁾ По согласованию с компетентными органами, при рутинных испытаниях партий продукции данное испытание может не выполняться, за исключением случаев, ко- гда это требуется в соответствии с указаниями в частной статье.

2.6.7. Микоплазмы

Если испытание на микоплазмы предписано для основного или рабочего клеточного банка, для посевной партии вирусов или для контрольных клеток, при­меняют как метод культивирования, так и метод индикаторной клеточной культу­ры. Если испытание предписано для вирусного сбора, большого количества вак­цины или готовой партии продукции, применяют метод культивирования. Метод индикаторной клеточной культуры может при необходимости также использовать­ся для контроля сред.

МЕТОД КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

ВЫБОР ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ

Испытание выполняют с использованием достаточного количества как твердых, так и жидких питательных сред для того, чтобы в избранных условиях инкубации был обеспечен рост небольшого количества микоплазм, которые могут присутствовать в испытуемом продукте. Жидкие среды должны содержать фено­ловый красный. Для ряда сред показано наличие удовлетворительных питатель­ных свойств, по крайней мере, для нижеперечисленных организмов. Для каждой новой партии среды должны быть подтверждены питательные свойства в отно­шении соответствующих организмов из списка.

Acholeplasma laidlawii (вакцины для медицинского и ветеринарного приме­нения, в процессе производства которых используются антибиотики)

Mycoplasma gallisepticum (в случаях, когда для производства вакцин исполь­зуются материалы, имеющие птичье происхождение или для вакцин, предназна­ченных для применения в птицеводстве)

Mycoplasma hyorhinis (ветеринарные вакцины, кроме птичьих)

Mycoplasma orale (вакцины для медицинского и ветеринарного применения)

Mycoplasma pneumoniae (вакцины для медицинского применения) или дру­гие подходящие виды, связанные с ферментацией D-глюкозы

Mycoplasma synoviae (в случаях, когда для производства вакцин использу­ются материалы, имеющие птичье происхождение или для вакцин, предназначен­ных для применения в птицеводстве).

Тест-штаммы представляют собой изоляты, подвергнутые не более, чем 15 пересевам, и хранящиеся в замороженном или лиофилизированном состоянии. После клонирования принадлежность штамма к требуемому виду определяется подходящим методом путем сравнения с типовыми культурами, например:

A. laidlawii NCTC 10116 CIP 75.27 ATCC 23206

M. gallisepticum NCTC 10115 CIP 104967 ATCC 19610

M. hyorhinis NCTC 10130 CIP 104968 ATCC 17981

M. orale NCTC 10112 CIP 104969 ATCC 23714

M. pneumoniae NCTC 10119 CIP 103766 ATCC 15531

M. synoviae NCTC 10124 CIP 104970 ATCC 25204

УСЛОВИЯ ИНКУБАЦИИ

Инокулированную среду делят на две равные части, одну из которых инку­бируют в аэробных условиях, а другую - в микроаэрофильных условиях; в случае твердых сред поддерживают атмосферную влажность, достаточную для предот­вращения высыхания поверхности. В случае аэробных условий при инкубации твердых сред в атмосфере должно присутствовать от 5 до 10% диоксида углеро­да. Инкубацию в микроаэрофильных условиях проводят в атмосфере азота, в ко­торой, в случае твердых сред, содержится от 5 до 10% диоксида углерода.

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА

Питательные свойства испытывают для каждой новой партии среды. Выбранные среды засевают соответствующими тест-организмами. На чашку диа­метром 60 мм, содержащую 9 мл твердой среды, наносят не менее 100 колоние-образующих единиц, а в контейнер вместимостью 100 мл, содержащий соответст­вующую жидкую среду, вносят не менее 40 колониеобразующих единиц; для каж­дого вида организмов используют отдельные чашки и контейнеры. Среды инкуби­руют в условиях, в которых проводится основное испытание (аэробных, микроаэ-рофильных или тех и других, в зависимости от потребностей тест-организма). Среда выдерживает испытание на питательные свойства, если наблюдается аде­кватный рост тест-организмов, сопровождаемый соответствующим изменением окраски жидкой среды.

ИНГИБИРУЮЩИЕ ВЕЩЕСТВА

Проводят испытание на питательные свойства в присутствии испытуемого продукта. Если рост тест-организмов заметно менее выражен, чем в отсутствии испытуемого продукта, то последний содержит ингибирующие вещества, требую­щие нейтрализации (или исключения их влияния другим способом, например, разбавлением) перед проведением испытания на микоплазмы. Эффективность нейтрализации или иного процесса проверяется путем повторения испытания на ингибирующие вещества после нейтрализации.

ИСПЫТАНИЕ АНАЛИЗИРУЕМОГО ПРОДУКТА НА МИКОПЛАЗМЫ

В случае твердых сред используют чашки диаметром 60 мм, содержащие 9 мл питательной среды. Каждая из используемых сред должна содержаться не ме­нее, чем в двух чашках. На каждую чашку наносят по 0,2 мл испытуемого продук­та; в каждую жидкую среду вносят испытуемый продукт в соотношении 10 мл на 100 мл среды. Инкубируют при температуре от 35 до 38⁰С в аэробных и микроаэ-рофильных условиях в течение 21 дня. Одновременно инкубируют порции по 100 мл каждой среды без испытуемого продукта для контроля. Если при добавлении испытуемого продукта происходит существенное изменение показателя рН, ис­ходное значение восстанавливают добавлением раствора хлористоводородной кислоты или гидроксида натрия. В первый, второй и третий дни после инокуляции выполняют пересев по 0,2 мл каждой из жидких культур на чашки с твердыми сре­дами (по две чашки для каждой из сред) и инкубируют при температуре от 35 до 38⁰С в аэробных и микроаэрофильных условиях в течение не менее 21 дня. Про­цедуру повторяют на шестой, седьмой и восьмой, а также на тринадцатый и че­тырнадцатый дни испытания. Состояние жидких сред контролируют каждые два или три дня и, в случае изменения окраски, выполняют пересев немедленно. Со­стояние твердых сред оценивают один раз в неделю.

Если в жидких средах обнаруживается бактериальное или грибковое за­грязнение, испытание повторяют. Если не ранее, чем через семь дней после ино­куляции, не более, чем одна чашка с каждой стадии испытания имеет случайные бактериальные или грибковые примеси или разбита, результаты, связанные с этой чашкой могут не учитываться, если при немедленной проверке на ней не об­наруживается признаков роста микоплазм. Если на любой стадии испытания бо­лее одной чашки подвергаются случайному загрязнению бактериями или грибами, или разбивается, испытание считают недействительным и повторяют.

Испытание проводят также для положительных контролей, приготовленных путем инокуляции не более 100 колониеобразующих единиц подходящего штам­ма, например, M. orale или M. pneumoniae.

В конце периодов инкубации все инокулированные твердые среды изучают под микроскопом для установления наличия микоплазм. Продукт выдерживает испытание, если ни на одной инокулированной среде не обнаружено роста мико-плазм. При обнаружении роста микоплазм испытание может быть проведено по­вторно с использованием удвоенного количества инокулята, сред и чашек; если роста микоплазм не обнаруживается, то продукт выдерживает испытание. Резуль­таты испытания недостоверны, если в положительных контролях не наблюдается роста соответствующих тест-организмов.

МЕТОД ИНДИКАТОРНОЙ КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ

Клеточные культуры окрашиваются флуоресцентным красителем, обла­дающим способностью связываться с ДНК. Микоплазмы детектируются по их ха­рактерной точечной или волокнистой флуоресценции на клеточной поверхности и, при высоком уровне загрязнения, в прилегающем пространстве.

ПРОВЕРКА СУБСТРАТА

Метод подвергают предварительному испытанию с использованием суб­страта клеточной культуры Веро и инокулята, содержащего не более 100 коло-ниеобразующих единиц хорошо растущего на жидкой или твердой среде штамма, и показывают возможность определения этим методом потенциальных примесей микоплазм, например, подходящих штаммов Mycoplasma hyorhinis и Mycoplasma orale. Могут использоваться и другие клеточные субстраты, например, производ­ственная линия клеток, если было показано, что чувствительность определения микоплазм не будет меньшей.

Метод испытания

Отбирают не менее 1 мл испытуемого продукта и используют его для засе­ва в двух повторностях индикаторной клеточной культуры, представляющей в со­вокупности не менее 25 см² площади клеточной культуры. Руководствуются ука­заниями подраздела «Процедура».

В испытание включают отрицательный (неинфицированный) контроль и два положительных контроля, содержащих микоплазмы, например, M. hyorhinis и M.

orale. В положительных контролях используют инокулят, содержащий не более 100 колониеобразующих единиц.

Если для вирусных суспензий на интерпретацию результатов влияют за­метные цитопатические эффекты, вирус может быть нейтрализован с использо­ванием специфической антисыворотки, не обладающей ингибирующим эффектом в отношении микоплазм или может использоваться субстрат клеточной культуры, не поддерживающий рост вируса. Для демонстрации отсутствия ингибирующего эффекта сыворотки выполняют положительные контрольные тесты в ее присутст­вии и отсутствии.

Процедура

1. Среду однородно засевают культурой (от 2х10⁴ до 2х10⁵ клеток в милли­литре, от 4х10³ до 2,5х10⁴ клеток на см²) и инкубируют при температуре 36±1⁰С не менее 2 дней. Вносят испытуемый продукт и инкубируют не менее 2 дней; выпол­няют не менее одного пересева. Последнюю субкультуру выращивают на покров­ных стеклах в подходящих контейнерах или на другой подходящей поверхности. Не допускают достижения слияния в последней субкультуре, так как это может привести к ингибированию окрашивания и ухудшить визуализацию микоплазм.

2. Среду извлекают и выбрасывают.

3. Монослой промывают раствором хлорида натрия в фосфатном буфере рН 7,4 R, затем смесью равных объемов этого раствора и подходящего фикси­рующего раствора и, наконец, чистым фиксирующим раствором; если для окра­шивания используется бисбензимид R, то подходящим фиксирующим раствором является свежеприготовленная смесь 1 объема ледяной уксусной кислоты R и 3 объемов метанола R.

4. Добавляют фиксирующий раствор и оставляют на 10 минут.

5. Фиксирующий раствор удаляют и выбрасывают.

6. Если монослой будет подвергаться окрашиванию позже, его полностью высушивают. (Требуется особое внимание при окрашивании высушенных стекол ввиду возможности возникновения артефактов).

7. Если монослой подлежит окрашиванию немедленно, фиксирующий рас­твор смывают дважды стерильной водой; промывные воды отбрасывают.

1. Добавляют рабочий раствор бисбензимида R или другой подходящий агент, обладающий способностью вызывать появление окраски при взаимодейст­вии с ДНК, и выдерживают в течение 10 минут.

1. Краситель удаляют и промывают монослой водой.

10. При необходимости каждое покровное стекло готовят к изучению путем нанесения капли смеси равных объемов глицерина и раствора хлорида натрия в фосфатном буфере рН 7,4 R; удаляют с краев стекла излишки смеси.

11. Стекла изучают методом эпифлуоресценции (фильтр возбуждения 330 нм / 380 нм, барьерный фильтр LP 440 нм) при 100-400-кратном (или большем) увеличении.

12. Изучая внеядерную флуоресценцию, сравнивают микроскопическую картину тест-культур с микроскопическими картинами отрицательного и положи­тельных контролей. Микоплазмы проявляют себя в виде точек или волокон, рас­положенных над цитоплазмой и иногда в межклеточном пространстве.

Испытуемый продукт выдерживает испытание, если в тест-культурах, на которые он был нанесен, нет признаков присутствия микоплазм. Результаты испытания недостоверны, если в положительных контролях не обнаруживается присутствия соответствующих тест-организмов.

Следующий раздел публикуется для информации.

СРЕДЫ, РЕКОМЕНДУЕМЫЕ ДЛЯ МЕТОДА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

Рекомендуются нижеследующие среды. Могут использоваться и другие среды при условии, что на каждой партии в присутствии и отсутствии испытуемого продукта продемонстрирована способность к поддерживанию роста микоплазм.

СРЕДЫ, РЕКОМЕНДУЕМЫЕ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ MYCOPLASMA GALLISEPTI­CUM

90,0 мл 20,0 мл 10,0 мл 1,0 мл 5,0 мл 0,25 мл 1,2 мл

Жидкая среда

Бульон из экстракта говяжьего сердца (1) Лошадиная сыворотка (не подвергнутая нагреву) Дрожжевой экстракт (250 г/л) Ацетат таллия (раствор концентрацией 10 г/л) Феноловый красный (раствор концентрацией 0,6 г/л) Пенициллин (20 000 МЕ/мл)

Дезоксирибонуклеиновая кислота (раствор концентрацией 0,6 г/л) Значение рН доводят до 7,8. Твердая среда

Готовят так же, заменяя бульон из экстракта говяжьего сердца на агар из экстракта говяжьего сердца, содержащий агар в концентрации 15 г/л.

СРЕДЫ, РЕКОМЕНДУЕМЫЕ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ MYCOPLASMA SYNOVIAE

Жидкая среда

Бульон из экстракта говяжьего сердца (1) 90,0 мл

Важнейшие витамины (2) 0,025 мл

Глюкозы моногидрат (раствор концентрацией 500 г/л) 2,0 мл

Поросячья сыворотка (инактивированная при 56⁰С 30 минут) 12,0 мл (З-Никотинамидадениндинуклеотид (раствор концентрацией 10 г/л) 1,0 мл

Цистеина гидрохлорид (раствор концентрацией 10 г/л) 1,0 мл

Феноловый красный (раствор концентрацией 0,6 г/л) 5,0 мл

Пенициллин (20 000 МЕ/мл) 0,25 мл

Смешивают растворы ( -никотинамидадениндинуклеотида и цистеина гид­рохлорида и через 10 минут добавляют к остальным компонентам. Значение рН доводят до 7,8.

Твердая среда

Бульон из экстракта говяжьего сердца (1) 90,0 мл

Ионагар (3) 1,4 г

Значение рН доводят до 7,8, стерилизуют автоклавированием, после чего добавляют:

Важнейшие витамины (2) 0,025 мл

Глюкозы моногидрат (раствор концентрацией 500 г/л) 2,0 мл

Поросячья сыворотка (не подвергнутая нагреву) 12,0 мл

( -Никотинамидадениндинуклеотид (раствор концентрацией 10 г/л) 1,0 мл

Цистеина гидрохлорид (раствор концентрацией 10 г/л) 1,0 мл

Феноловый красный (раствор концентрацией 0,6 г/л) 5,0 мл

Пенициллин (20 000 МЕ/мл) 0,25 мл

СРЕДЫ, РЕКОМЕНДУЕМЫЕ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКОПЛАЗМ, ИМЕЮЩИХ ОТЛИЧНОЕ ОТ ПТИЧЬЕГО ПРОИСХОЖДЕНИЕ

(4) 800 мл 67 мл 135 мл 248 мл 60 мл 250 мг 250 мг 4,5 мл 3 мл 165 мл 165 мл

Жидкая среда

Сбалансированный солевой раствор Хэнкса (модифицированный) Дистиллированная вода Экстракт из сердца и мозгов (5) Бульон PPLO (6) Дрожжевой экстракт (170 г/л) Бацитрацин Метициллин

Феноловый красный (5 г/л) Ацетат таллия (раствор концентрацией 56 г/л) Лошадиная сыворотка Поросячья сыворотка

Значение рН доводят до 7,4 - 7,45.

Твердая среда

Сбалансированный солевой раствор Хэнкса (модифицированный) (4) 200 мл

DEAE-декстран 200 мг

Ионагар (3) 15,65 мг

Хорошо перемешивают и стерилизуют автоклавированием. Охлаждают до 100⁰С. Добавляют к 1740 мл вышеописанной жидкой среды.

(1) Бульон из настоя говяжьего сердца

Говяжье сердце (для приготовления экстракта) 500 г

Пептон 10 г

Натрия хлорид 5 г

Дистиллированная вода до 1000 мл

Стерилизуют автоклавированием.

Высокочистый агар для использования в микробиологии и иммунологии го­товят ионообменным методом с получением продукта исключительной чистоты, прозрачности и прочности образующегося геля. Приблизительное содержание в ионагаре:

Вода	12,2%
Зола	1,5%
Зола, нерастворимая в кислоте	0,2%
Хлор	0
Фосфаты (в пересчете на Р2О5)	0,3%
Общий азот	0,3%
Медь	0,0008%
Железо	0,017%
Кальций	0,28%
Магний	0,32%

(4) Сбалансированный солевой раствор Хэнкса (модифицированный)

Натрия хлорид 6,4 г

Калия хлорид 0,32 г

Магния сульфат гептагидрат 0,08 г

Магния хлорид гексагидрат 0,08 г

Кальция хлорид безводный 0,112 г

Натрия гидрофосфат дигидрат 0,0596 г

Калия дигидрофосфат безводный 0,048 г

Дистиллированная вода до 1000 мл

(5) Экстракт из сердца и мозгов

Экстракт мозга теленка 200 г

Экстракт говяжьего сердца 250 г

Протеозный пептон 10 г

Глюкозы моногидрат 2 г

Натрия хлорид 5 г

Натрия гидрофосфат безводный 2,5 г

Дистиллированная вода до 1000 мл

(6) Бульон PPLO

Экстракт говяжьего сердца Пептон

Натрия хлорид Дистиллированная вода

50 г 10 г 5 г

до 1000 мл