2.4.23. Стерины в жирных маслах

ОТДЕЛЕНИЕ СТЕРИНОВОЙ ФРАКЦИИ

Получают неомыляемые вещества жирного масла и затем отделяют стериновую фракцию методом тонкослойной хроматографии (2.2.27), используя пластинки, покрытые тонким слоем силикагеля G P толщиной от 0,3 мм до 0,5 мм.

Испытуемый раствор (а). В колбу вместимостью 150 мл, снабженную обратным холодильником, помещают раствор 2 г/л бетулина Р в метиленхлориде Р в таком объеме, чтобы количество бетулина соответствовало около 10% содержания стеринов в образце, взятом для определения (т.е. в случае оливкового масла прибавляют 500 мкл, в случае других растительных масел 1500 мкл раствора бетулина). Выпаривают до сухого остатка в токе азота Р. Если в частной статье определяется только содержание индивидуальных стеринов в процентах к стериновой фракции, раствор бетулина можно не прибавлять.

В колбу помещают 5,00 г испытуемого вещества. Прибавляют 50 мл 2 М раствора калия гидроксида спиртового Р и нагревают на водяной бане в течение 1 ч, часто перемешивая содержимое колбы круговыми движениями. Охлаждают до температуры ниже 25^оС и количественно переносят содержимое колбы в делительную воронку, содержащую 100 мл воды Р. Осторожно встряхивают с тремя порциями эфира, свободного от пероксидов Р, по 100 мл каждая. Эфирные слои собирают в другую делительную воронку, содержащую 40 мл воды Р, слегка встряхивают в течение нескольких минут, оставляют до расслоения и отбрасывают водный слой. Эфирный слой встряхивают с несколькими порциями воды Р, по 40 мл каждая, до тех пор, пока водный слой не перестанет давать щелочную реакцию по фенолфталеину. Эфирный слой количественно переносят в колбу, высушенную до постоянной массы, промывая делительную воронку эфиром, свободным от пероксидов Р. Эфир выпаривают с необходимыми предосторожностями, к остатку прибавляют 6 мл ацетона Р. Осторожно удаляют растворитель в токе азота Р. Высушивают до постоянной массы при температуре от 100°С до 105°С, охлаждают в эксикаторе и взвешивают. Остаток растворяют в минимальном объеме метиленхлорида Р.

Испытуемый раствор (b). В колбу вместимостью 150 мл, снабженную обратным холодильником, помещают 5,00 г рапсового масла Р и далее поступают, как указано в приготовлении испытуемого раствора (а), начиная со слов «Прибавляют 50 мл 2 М раствора калия гидроксида спиртового Р».

Испытуемый раствор (с). В колбу вместимостью 150 мл, снабженную обратным холодильником, помещают 5,00 г подсолнечного масла Р и далее поступают, как указано в приготовлении испытуемого раствора (а), начиная со слов «Прибавляют 50 мл 2 М раствора калия гидроксида спиртового Р».

Раствор сравнения. 25 мг холестерина Р и 10 мг бетулина Р растворяют в 1 мл метиленхлорида Р.

Для каждого испытуемого раствора используют отдельную пластинку. На каждую из пластинок наносят полосой размером (20x3) мм 20 мкл раствора сравнения и полосой размером (40x3) мм 400 мкл испытуемого раствора (а) или испытуемого раствора (b), или испытуемого раствора (с), соответственно. Пластинки помещают в камеру со смесью растворителей эфир Р - гексан Р (35:65). Когда фронт растворителей пройдет 18 см от линии старта, пластинки вынимают из камеры, высушивают в токе азота Р, опрыскивают раствором 2 г/л дихлорфлуоресцеина Р в этаноле Р и просматривают в УФ­свете при длине волны 254 нм. На хроматограмме раствора сравнения обнаруживаются полосы, соответствующие холестерину и бетулину. На хроматограммах испытуемых растворов обнаруживаются полосы с близкими значениями R_f, соответствующие стеринам. С хроматограммы каждого испытуемого раствора снимают область покрытия, на которой расположены полосы стеринов, а также дополнительно зоны на 2-3 мм выше и ниже видимых зон раствора сравнения и помещают раздельно в три колбы вместимостью 50 мл каждая. В каждую колбу прибавляют по 15 мл теплого метиленхлорида Р и встряхивают. Каждый раствор фильтруют через стеклянный фильтр (40) или подходящую фильтровальную бумагу и промывают каждый фильтр тремя порциями метиленхлорида Р, по 15 мл каждая. Объединенные фильтраты и смывы помещают в три колбы, высушенные до постоянной массы, выпаривают до сухого остатка в токе азота Р и взвешивают.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТЕРИНОВ

Определение стеринов проводят методом газовой хроматографии (2.2.28).

Все операции проводят, защищая растворы и реактивы от влаги, растворы готовят непосредственно перед применением.

Испытуемый раствор. К выделенным из испытуемого вещества методом тонкослойной хроматографии стеринам прибавляют свежеприготовленную смесь: хлортриметилсилан - гексаметилдисилазан Р - пиридин безводный Р (1:3:9). (0,02 мл смеси на миллиграмм остатка). Осторожно встряхивают до полного растворения остатка и оставляют в эксикаторе над фосфора (v) оксидом Р на 30 мин. При необходимости центрифугируют и используют надосадочную жидкость.

Раствор сравнения (а). К 9 частям стеринов, выделенных из рапсового масла Р методом тонкослойной хроматографии, прибавляют 1 часть холестерина Р. К полученной смеси прибавляют свежеприготовленную смесь: хлортриметилсилан - гексаметилдисилазан Р - пиридин безводный Р (1:3:9) (0,02 мл смеси на миллиграмм смеси стеринов). Осторожно встряхивают до полного растворения остатка и оставляют в эксикаторе над фосфора (V) оксидом Р на 30 мин. При необходимости центрифугируют и используют надосадочную жидкость.

Раствор сравнения (b). К стеринам, выделенным из подсолнечного масла Р методом тонкослойной хроматографии, прибавляют свежеприготовленную смесь: хлортриметилсилана Р - гексаметилдисилазан - пиридин безводный Р (1:3:9) (0,02 мл смеси на миллиграмм смеси стеринов). Осторожно встряхивают до полного растворения остатка и оставляют в эксикаторе над фосфора (V) оксидом Р на 30 мин. При необходимости центрифугируют и используют надосадочную жидкость.

Хроматографируют на газовом хроматографе с пламенно-ионизационным детектором в следующих условиях:

• кварцевая колонка длиной от 20 м до 30 м и внутренним диаметром от 0,25 мм до 0,32 мм, покрытая поли[метил(95)фенил(5)]силоксаном Р или поли[метил(94)фенил(5)винил(1)]силоксаном Р с толщиной слоя 0,5 мкм,

• газ-носитель - водород для хроматографии Р (линейная скорость от 30 см/с до 50 см/с) или гелий для хроматографии Р (линейная скорость от 20 см/с до 35 см/с). Линейную скорость измеряют следующим способом: в

условиях определения стеринов вводят от 1 мкл до 3 мкл метана или пропана. Измеряют время в секундах, необходимое для прохождения газа через колонку от момента введения до появления пика (t_m). Линейную скорость вычисляют по формуле L/t_m, где L - длина колонки в сантиметрах;

• деление потока - 1:50 или 1:100;

• температура колонки - 260°С;

• температура инжектора - 280°С;

• температура детектора - 290°С.

Хроматографируют в указанных условиях по 1 мкл каждого раствора.

На хроматограмме раствора сравнения (а) обнаруживается четыре основных пика, соответствующих холестерину, брассикастерину, кампестерину и (З-ситостерину; на хроматограмме раствора сравнения (b) обнаруживается четыре основных пика, соответствующих кампестерину, стигмастерину, (З-ситостерину и А7-сигмастенолу. Времена удерживания стеринов относительно (З-ситостерина даны в Табл. 2.4.23.-1.

Пик внутреннего стандарта (бетулин) должен быть четко отделен от пиков определяемых стеринов.

Идентифицируют пики, обнаруженные на хроматограмме испытуемого раствора, и вычисляют процентное содержание каждого стерина в стериновой фракции испытуемого вещества по формуле:

С = — ■ 100 S

где:

С — процентное содержание стеарина;

А — площадь пика, соответствующего определяемому стерину; S — сумма площадей всех пиков, соответствующих компонентам, указанным в Табл. 2.4.23.-1.

Если это указано в частной статье, вычисляют количество каждого стерина в миллиграммах, содержащееся в 100 г испытуемого вещества, по формуле:

^ A ■ m_S-100

С = ^S

As ■ m

где:

С —количество стеарина в миллиграммах;

А — площадь пика, соответствующего определяемому компоненту; A_s — площадь пика, соответствующего бетулину; m — масса навески образца испытуемого вещества, в граммах; m_s — масса прибавленного бетулина Р, в миллиграммах.