2.7.17. Количественное определение антитромбина III человека

Содержание антитромбина III в испытуемом препарате определяют путем сравнения его способности к инактивации тромбина в присутствии избыточного количества гепарина с такой же способностью препарата сравнения антитромбина III человека, калиброванного в Международных Единицах. Различные количества испытуемого препарата смешивают с определенным количеством тромбина и определяют активность остаточного количества тромбина с использованием подходящего хромогенного субстрата.

За Международную Единицу принимают активность установленного количества Международного Стандарта концентрата антитромбина III человека. Эквивалентность Международного Стандарта в Международных Единицах устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.

Методика определения. Готовят два независимых ряда из трех или четырех разведений испытуемого препарата и препарата сравнения в диапазоне от 1/75 до 1/200 исходя из концентрации 1 МЕ/мл с использованием буферного раствора tris-EDTA BSA рН 8,4 R, содержащего 15 МЕ гепарина в миллилитре.

По 200 мкл каждого из разбавлений выдерживают при 37⁰С в течение 1-2 минут. К каждому разведению добавляют по 200 мкл раствора бычьего тромбина R с содержанием 2 МЕ/мл в буферном растворе tris-EDTA BSA рН 8,4 R, перемешивают и выдерживают при 37⁰С в течение в точности 1 минуты. Добавляют 500 мкл подходящего хромогенного субстрата (например, D-фенилаланил^-пипеколил^-аргинина 4-нитроанилида, растворенного в воде R с получением раствора, содержащего 4 ммоль/л и дополнительно разбавленного до концентрации, подходящей для проведения количественного определения с использованием буферного раствора tris-EDTA BSA рН 8,4 R без добавления альбумина). Тотчас же начинают фиксировать изменение оптической плотности при длине волны 405 нм (2.2.25), и продолжают измерение в течение не менее 30 секунд. Вычисляют скорость изменения оптической плотности (АА/мин). (Определение также может производиться методом конечной точки путем прерывания реакции добавлением уксусной кислоты и измерением оптической плотности при длине волны 405 нм.)

Скорость изменения оптической плотности (АА/мин) обратно пропорциональна активности антитромбина III.

Проверяют достоверность определения и вычисляют активность испытуемого препарата с использованием обычных статистических методов (например, 5.3. Статистический анализ результатов биологических испытаний и количественных определений).

2.7.18. Количественное определение фактора свертывания крови II

Количественное определение фактора свертывания крови II производят по его специфической активации с образованием фактора IIa. Фактор IIa оценивают на основании сопоставления его активности по расщеплению специфического хромогенного пептидного субстрата с такой же активностью Международного Стандарта или препарата сравнения, калиброванного в Международных Единицах.

За Международную Единицу принимают активность фактора II в установленном количестве Международного Стандарта, состоящего из высушенного из замороженного состояния концентрата человеческого фактора свертывания крови II. Эквивалентность Международного Стандарта в Международных Единицах устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.

Хромогенный метод количественного определения включает две последовательные стадии: индуцируемая змеиным ядом активация фактора II и ферментативное расщепление хромогенного субстрата фактором На с образованием хромофора, который определяют спектрофотометрически. В соответствующих условиях испытания существует линейная зависимость между активностью фактора На и расщеплением хромогенного субстрата.

РЕАГЕНТЫ

Специфический активатор фактора II из яда эфы (Экарин). Белок, получаемый из яда эфы (Echis carinatus), специфически активирующий фактор II. Восстанавливают в соответствии с инструкциями производителя. Восстановленный препарат хранят при 4⁰С и используют в течение 1 месяца.

Хромогенный субстрат фактора IIa. Специфический хромогенный субстрат для фактора IIa, например: Н^-фенилаланил^-пипеколил^-аргинина 4-нитроанилида дигидрохлорид, 4-толуолсульфонил-глицил-пролил^-аргинина 4­нитроанилид, Н^-циклогексилглицил-а-аминобутирил^-аргинина 4-нитроанилид, D- циклогексилглицил-L-аланил-L-аргинина 4-нитроанилида диацетат.

Восстанавливают в соответствии с инструкциями изготовителя.

Буфер для разведений. Раствор, содержащий 6,06 г/л трис-(гидроксиметил)-аминометана R, 17,53 г/л натрия хлорида R, 2,79 г/л (этилендинитрило)-тетрауксусной кислоты R и 1 г/л бычьего альбумина R или человеческого альбумина R. При необходимости доводят значение рН до 8,4 с использованием хлористоводородной кислоты R.

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Испытуемый раствор. Испытуемый препарат разбавляют буфером для разведений, получая раствор с содержанием 0,015 МЕ фактора II в миллилитре. Готовят не менее трех дальнейших разведений с использованием того же буфера.

Раствор сравнения. Препарат сравнения разбавляют буфером для разведений, получая раствор с содержанием 0,015 МЕ фактора II в миллилитре. Готовят не менее трех дальнейших разведений с использованием того же буфера.

Все растворы перед испытанием нагревают на водяной бане до 37⁰С.

Нижеописанные условия определения относятся к титрационным микропланшетам. Если определение производят в пробирках, объемы могут изменяться при условии неизменности соотношений компонентов в смесях.

Определение выполняют с использованием титрационного микропланшета, поддерживаемого при 37⁰С. По 25 мкл каждого из разведений испытуемого раствора или раствора сравнения вносят в каждый из рядов ячеек. К содержимому каждой ячейки добавляют 125 мкл буфера для разведений, затем 25 мкл экарина и инкубируют в точности 2 минуты. К содержимому каждой ячейки добавляют 25 мкл хромогенного субстрата фактора IIa.

Регистрируют скорость изменения оптической плотности (2.2.25) при длине волны 405 нм непрерывно в течение 3 минут и получают среднюю скорость изменения оптической плотности (АА/мин). При невозможности непрерывной регистрации, оптическую плотность при 405 нм регистрируют с подходящими последовательными интервалами, например, продолжительностью 40 секунд, строят на миллиметровой бумаге график зависимости оптической плотности от времени и вычисляют из уклона полученной прямой значение АА/мин. Из значений АА/мин для каждого разведения испытуемого препарата и препарата сравнения вычисляют активность испытуемого препарата и проверяют достоверность определения с использованием обычных статистических методов (5.3).