Проведение анализа

Добавить в кювету	Опытная проба	Холостая проба	Стандартная проба
1. Сыворотка	10 мкл	--	--
2. Стандарт	--	--	10 мкл
3. Дистиллиро-ванная вода	--	10 мкл	--
4. Реагент	1 мл	1 мл	1 мл

Перемешать содержимое каждой пробирки. Инкубировать 20 мин при температуре 37С. Измерить оптическую плотность опытной и стандартной проб против холостой пробы при длине волны 500-650 нм.

Расчет

Расчет по стандарту концентрации мочевины в сыворотке крови проводят по формуле:

Аоп С (ммоль/л) = -----------  Сст, Аст

где А_{оп / ст}– оптическая плотность опытной и стандартной проб,

соответственно;

С_ст – концентрация стандарта (ммоль/л).

Если концентрация мочевины превышает 26,8 ммоль/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемый образец (сыворотка или моча) следует развести 1:1 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 2.

Клинико-диагностическое значение:Отклонения от нормы содержания мочевины в сыворотке крови зависят от скорости ее биосинтеза и выделения.

Увеличение концентрации мочевины в сыворотке крови – один из главных признаков нарушения функции почек. Из фракций остаточного азота раньше всего повышается уровень мочевины и может достигать 90% от всего остаточного азота.

Повышение концентрации мочевины в сыворотке крови может носить и внепочечный характер: при потере жидкости организмом, при усиленном распаде белков (острая желтая атрофия печени, тяжелые заболевания).

Уменьшение содержания мочевины в сыворотке крови наблюдается при заболеваниях печени (паренхиматозная желтуха, цирроз) по причине нарушенного синтеза мочевины в гепатоцитах.

Тема 6. Обмен сложных белков

Лабораторная работа № 11.

Определение концентрации мочевой кислоты в биологических жидкостях ферментативным методом

Принцип метода: Мочевая кислота под действием фермента уриказы окисляется до алантоина с образованием перекиси водорода. Пероксид водорода реагирует с хромогеном (4-аминоантипирин с N-этил-N-(гидрокси-3-сульфопропил)-m-толуидином [TOOS]) с образованием сине-фиолетового красителя:

Уриказа Мочевая кислота + Н2О + О2 ----------------> Алантоин + СО2 = Н2О2

Пероксидаза 2Н2О2 + ТООS + 4-Амноантипирин ------------------------> Индамин + 3Н2О

Интенсивность окраски раствора при длине волны 550 нм прямо пропорциональна концентрации мочевой кислоты в нем.

Линейность метода:65,7 -1190 мкмоль/л.

Норма:

Сыворотка крови – мужчины – 214-488 мкмоль/л (25-37С);

женщины – 137-363 мкмоль/л (25-37С).

Концентрация мочевой кислоты сохраняется стабильной в сыворотке/ плазме в течение 3 дней при комнатной температуре, при температуре хранения 2-8С – в течение 7 дней, при температуре –20С – в течение 6 месяцев.

Стабильность концентрации мочевой кислоты в моче – 4 дня при комнатной температуре.

Оборудование и реагенты:

1. Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 550 нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 25-37С;

2. Секундомер;

3. Автоматические пипетки на 20 мкл, 250 мкл и 1000 мкл;

4. Сыворотка крови/ гепаринизированная или ЭДТА- плазма / моча. Мочу предварительно развести дистиллированной водой в соотношении 1:10;

5. Реагент 1 (ТООS 1 ммоль/л в фосфатном буфере, рН 7,0 100 ммоль/л);

6. Реагент 2 (уриказа 50 Е/л, пероксидаза1000 Е/л, 4-аминоантипирин 0,3 ммоль/л в фосфатном буфере, рН 7,0 100 ммоль/л);

7. Стандарт (раствор мочевой кислоты 357 мкмоль/л);

8. Дистиллированная вода.