ЗАНЯТИЕ 1.ТЕМА:МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Электронная микроскопия

Рис. 9. Трансмиссионный и сканирующий электронные микроскопы

Трансмиссионный (просвечивающий) электронный микроскоп дает двумерное (плоское) изображение. При сканирующей (растровой) электронной микроскопии пучок электронов быстро сканирует поверхность образца, вызывая излучение, которое посредством катодно-лучевой трубки формирует трехмерное изображение на светящемся экране; этот процесс сходен с формированием телевизионного изображения. Разрешающая способность сканирующего микроскопа достигает 3 нм, увеличение – 300 000. Кроме того, существуют комбинированные электронные микроскопы, которые могут работать в просвечивающем, сканирующем, либо в двух режимах одновременно. Электронная микроскопия позволяет изучить структуру микроорганизмов на макромолекулярном и субклеточном уровнях.

Задание

Научиться настраивать микроскоп и микроскопировать с иммерсионным объективом. В процессе работы с микроскопом следует учитывать наиболее распространенные ошибки:

1)использование предметных стекол большой толщины (более 1,1–1,2 мм) не позволяет установить свет по Кёлеру (их толщина больше рабочего расстояния конденсора);

2)применение нестандартных покровных стекол (более 0,17 мм толщины) при использовании иммерсионных объективов может привести к повреждению фронтальной линзы, при использовании сильных сухих систем (×40) не позволяет получить изображение высокого качества;

3)недопустимо использование суррогатов иммерсионного масла, так как их оптические характеристики могут отличаться от стандартных, что приведет к ухудшению качества изображения; кроме того, они могут содержать агрессивные вещества, повреждающие линзы и растворяющие клей, ко-

ЗАНЯТИЕ 1.ТЕМА:МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Электронная микроскопия

торым эти линзы склеены; 4) абсолютно недопустимо произвольное раскрытие апертурной ирис-

диафрагмы конденсора; полностью открытая диафрагма конденсора приводит к потере контраста, полностью закрытая – к ухудшению качества изображения (появление дифракционных ободков).

Планвыполненияработы

1. НастройкапоКёлеру

Правильное освещение препарата является одним из основных условий успешной микроскопии. Лучший способ освещения основан на системе Кёлера и осуществляется в определенной последовательности.

1. Провести предварительную подготовку:

а) поставить осветитель на расстоянии 20–25 см от зеркала микроско-

па;

б) положить препарат на предметный столик; в) установить объектив ×8; г) поднять конденсор максимально вверх; д) убрать матовое стекло;

е) открыть полностью диафрагму конденсора; ж) установить плоское зеркало под углом 45° к лучу света и конденсо-

ру микроскопа; з) закрыть диафрагму осветителя, оставив маленький “зрачок”.

2.Включить осветитель и направить луч света в центр зеркала.

3.Закрыть зеркало белым экраном и, передвигая патрон лампы осветителя вдоль его корпуса, добиться четкого изображения на экране спирали лампы накла.

4.Убрать экран и перевести луч света в поле зрения, получив в его центре изображение светлого пятна.

5.Найти изображение объекта.

6.Меняя положение конденсора, добиться четкого изображения контура светлого пятна в поле зрения.

7.Открыть полностью диафрагму осветителя.

8.Микроскоп настроен, и регулировать освещение теперь можно только с помощью трансформатора.

9.Недопустимо произвольное опускание и поднятие конденсора для регулирования освещенности препарата. После установки света по Кёлеру, положение конденсора изменять нельзя!

2.Работасиммерсионнымобъективом

1.Поставить объектив с увеличением ×90 или ×100.

2.На мазок нанести каплю иммерсионного масла.

3.Под контролем глаза (смотрите на препарат сбоку) медленно погрузить фронтальную линзу в каплю масла. Глядя в окуляр, вращая макровинт, найти изображение объекта.

4.После работы немедленно убрать салфеткой масло с объектива. Если

ЗАНЯТИЕ 1.ТЕМА:МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Электронная микроскопия

необходимо сохранить препарат, иммерсионное масло осторожно снимают ваткой, смоченной в ксилоле. Ксилол удаляют, накладывая на препарат полоску фильтровальной бумаги.

5.Просмотреть постоянный препарат предложенного микроорганизма

собъективами ×40 и ×90.

6.Сделать зарисовку.

Вопросыдлясамостоятельногоконтроля

1.Как организована учебная микробиологическая лаборатория и рабочее место в ней?

2.Как обеспечивается безопасность работы в микробиологической лаборатории?

3.Какие действия запрещаются в микробиологической лаборатории?

4.Какие типы микроскопов используют в микробиологических исследованиях?

5.Из каких частей состоит микроскоп и каково их назначение?

6.Какими показателями характеризуются объективы?

7.Как определить оптимальную величину увеличения окуляра?

8.Что такое разрешающая способность микроскопа?

9.Как проводится настройка освещения по Кёлеру?

10.Для чего используется иммерсионная микроскопия?

ЗАНЯТИЕ 2 ТЕМА: ПРАВИЛА РАБОТЫ

С МИКРООРГАНИЗМАМИ. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРИЖИЗНЕННЫХ И ПОСТОЯННЫХ ПРЕПАРАТОВ

Основное требование при работе с микроорганизмами – соблюдение асептики, т. е. таких условий, при которых в пробирку с изучаемой культурой не смогли бы попасть другие микроорганизмы (например, из воздуха, с предметов, используемых в процессе выполнения работы). Кроме того, нужно иметь в виду, что среди микроорганизмов многие условно патогенны, что требует повышенного внимания и аккуратности в работе.

Для работы с микроорганизмами используют специальные бактериологические петли, иглы, шпатели. Бактериологические петли изготовляют из проволоки, которую закрепляют в специальных металлических держателях или впаивают в стеклянные палочки. Толщина игл и петель не должна превышать 0,5 мм (рис. 10).

Рис. 10. Бактериологическая петля (1) и шпатель Дригальского (2)

Выращивают микроорганизмы в стеклянной посуде: пробирках, колбах или чашках Петри. В пробирках микроорганизмы культивируют как в жид-

ЗАНЯТИЕ 2ТЕМА: ПРАВИЛА РАБОТЫ СМИКРООРГАНИЗМАМИ.

ких, так и на плотных средах. Пробирки со средами и культурами при работе следует устанавливать на штативах.

Бактериологическая петля прокаливается, пробки и край пробирки фламбируются. Если в работе используются суспензии микроорганизмов или культуры, выращенные на жидких средах, они берутся предварительно простерилизованной пипеткой, у которой широкий конец закрыт ватой. Такие пипетки стерилизуются и хранятся завернутыми в бумагу (каждая отдельно).

Изучают микроорганизмы, изготавливая препараты из них. Для этого применяют чистые, хорошо обезжиренные стекла, на поверхности которых капля воды свободно растекается. С этой целью промытые и высушенные стекла натирают хозяйственным мылом, увлажняют дыханием и протирают салфеткой.

При микроскопировании можно использовать культуры, выращенные в жидких средах. Культуры, выращенные на твердых средах, можно суспендировать (развести) с помощью стерильной петли или иглы в капле стерильной жидкой среды или какого-нибудь раствора, но не водопроводной воды, до слабого помутнения. В зависимости от цели исследования готовят прижизненные или фиксированные препараты.

Для прижизненных наблюдений наиболее часто готовят препараты «раздавленная капля» или «висячая капля». Работу проводят в следующем порядке:

1)приготовить предметное и покровное стекла;

2)зажечь спиртовку;

3)взять пробирку со стерильной водой в левую руку и поместить её наклонно между большим и указательным пальцем на расстоянии 3–5 см от пламени;

4)в правую руку взять петлю, простерилизовать ее в пламени спиртовки, включая часть петледержателя, которая при работе помещается в пробирку;

5)мизинцем правой руки зажать пробку пробирки, повернуть, вынуть

ееи держать, не касаясь окружающих предметов;

6)обжечь края пробирки и взять петлей каплю воды, поместить её на предметное стекло;

7)обжечь края пробирки и пробку, закрыть пробирку и поставить в

штатив;

8)прожечь петлю;

9)открыть пробирку с культурой так же, как в п. 5;

10)стерильную петлю ввести в пробирку с культурой, охладить, прикоснувшись к внутренней поверхности пробирки, а затем взять ею небольшое количество микроорганизмов;

11)петлей с микроорганизмами сделать штрих на стекле внутри капли воды. После этого петлю прожечь и охладить, прикоснувшись к стеклу;

12)растереть штрих петлей круговыми движениями, чтобы получилась слегка опалесцирущая суспензия;

ЗАНЯТИЕ 2ТЕМА: ПРАВИЛА РАБОТЫ СМИКРООРГАНИЗМАМИ.

13)петлю прожечь;

14)полученную суспензию микроорганизмов накрыть покровным стеклом и микроскопировать.

Чтобы в поле зрения не было пузырьков воздуха, нужно, расположив покровное стекло под углом 40–45°, прикоснуться им к краю капли и, когда она распределится вдоль грани, осторожно накрыть каплю.

Препарат можно подкрасить метиленовым синим (в концентрации 0,01–0,001), капнув непосредственно в препарат или поместив каплю красителя у края покровного стекла, с противоположной стороны – полоску фильтровальной бумаги.

При изготовлении препарата нужно учитывать размер капли, который должен быть равен приблизительно объему двух рисовых зерен. Маленькая капля быстро высыхает, при большой покровное стекло плавает на поверхности капли, что мешает качественному изображению объекта при микроскопировании.

Висячая капля. На середину необезжиренного покровного стекла наносят очень маленькую, с четкими краями каплю суспензии микроорганизмов, как описано выше. Каплю материала покрывают предметным стеклом с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином. Предметное стекло

сприлипшим к нему покровным стеклом переворачивают. Капля оказывается висячей в герметически закрытой влажной камере, из которой жидкость испаряется очень медленно, и поэтому препарат долгое время остается пригодным для наблюдения. Висячую каплю микроскопируют с плоским зеркалом и суженной диафрагмой.

Фиксированный (постоянный) препарат готовят следующим образом:

1)приготовить суспензию микроорганизмов методом, аналогичным вышеописанному;

2)с помощью стерильной бактериологической петли распределить суспензию тонким слоем на поверхности предметного стекла в виде пятна диаметром около 1 см;

3)высушить мазок на воздухе;

4)фиксировать мазок в пламени спиртовки. Для этого препарат три раза проводят в средней части пламени спиртовки. При этом микроорганизмы погибают, хорошо прикрепляются к стеклу, становятся более восприимчивыми к красителю. Можно вместо термической проводить химическую фиксацию, предусматривающую применение средств, вызывающих коагуляцию белков. В этом случае она осуществляется с помощью определенных химических веществ (например, метиловый, этиловый спирты, формалин) или различных смесей (например, уксусная кислота, абсолютный этиловый спирт и хлороформ – фиксирующая смесь Карнуа).

Для микроскопического исследования приготовленные мазки, высушенные и зафиксированные, подвергают окраске. Окраска бывает простая и сложная. Простая окраска заключается в нанесении на мазок какой-либо одной краски на определенное время. Чаще всего для простой окраски приме-