ЗАНЯТИЕ 14ТЕМА: МИКРООРГАНИЗМЫ, ОСУЩЕСТВЛЯЮЩИЕ МАСЛЯНОКИС. БРОЖЕНИЕ.

Получение накопительной культуры маслянокислых клостридий

мел (для нейтрализации масляной кислоты) и заливают водопроводной водой на 3/4 объема. Пробирки прогревают на водяной бане 15 минут при 80 °С, при этом уничтожаются вегетативные клетки и нетермостойкие споры многих микроорганизмов, а также удаляется воздух из среды. Затем пробирки закрывают пробками и культивируют при 35 °С. Через 3–5 дней ломтики картофеля всплывают, наблюдается обильное газообразование, в жидкости легко обнаруживаются бактериальные клетки с плектридиальным и клостридиальным типом спорообразования.

На картофельной среде часто выделяется C. butyricum. Для выделения других возбудителей маслянокислого брожения используют соответствующие питательные среды. Например, накопительные культуры пектиноразрушающих бактерий (C. pectinovorum, C. felsineum) получают методом Фрибеса. Снопики из льняной соломки (или стебля крапивы) вываривают в кипящей воде в пробирке в течение 5–10 минут, чтобы удалить экстрактивные вещества. Воду сливают, снопики заливают водопроводной водой высоким слоем, кипятят 15 минут, затем охлаждают до 25–35 °С. В снопик помещают несколько соломинок льна, не подвергшихся кипячению, и культивируют при 28–30 °С. Через 3–4 суток при наличии пектинразрушающих бактерий наблюдается помутнение среды и газообразование, при этом снопик всплывает на поверхность. Для приготовления микроскопического препарата из снопика извлекают кусочек стебля и делают соскоб с поверхности скальпелем на предметное стекло в каплю воды.

Характерным свойством C. pectinovorum является накопление гранулезы, которая располагается прерывисто. У C. felsineum гранулеза заполняет всю клетку, за исключением конца клетки, где располагается спора.

Образование масляной кислоты в среде обнаруживают по реакции с хлорнокислым железом: 5 мл культуральной жидкости переносят в пробирку, добавляют 2 мл 10 %-го раствора хлорнокислого железа и нагревают до кипения. Образующийся раствор маслянокислого железа имеет кровавокрасный цвет.

Задание

Ознакомиться с особенностями морфологии бактерий рода Clostridium. Приготовить препарат с окрашенными включениями гранулезы.

Планвыполненияработы

1.Приготовить и просмотреть прижизненный препарат накопительной культуры сахаролитических клостридий.

2.Произвести микрохимическую реакцию на гранулезу. На предметное стекло поместить каплю культуры клостридий, добавить каплю раствора Люголя. Накрыть покровным стеклом и промикроскопировать. Гранулеза окрашивается йодом в фиолетовый цвет, а гликоген – в красно-бурый. Сде-

ЗАНЯТИЕ 14ТЕМА: МИКРООРГАНИЗМЫ, ОСУЩЕСТВЛЯЮЩИЕ МАСЛЯНОКИС. БРОЖЕНИЕ.

Получение накопительной культуры маслянокислых клостридий

лать зарисовки.

Вопросыдлясамостоятельногоконтроля

1.Какие продукты могут образовываться в результате маслянокислого брожения? Какие реакции ведут к образованию масляной кислоты?

2.Какие микроорганизмы осуществляют маслянокислое брожение?

3.На основании каких признаков определяется принадлежность бакте-

рий к роду Clostridium?

4.Какие виды субстратов могут сбраживать клостридии? На какие группы делятся клостридии по данному признаку?

5.Назовите типы брожений, осуществляемых клостридиями.

6.Какие свойства маслянокислых клостридий используют при получение накопительной культуры?

7.Как можно выявить гранулезу и гликоген в клетках клостридий при микроскопировании?

8.Возбудителями каких заболеваний являются клостридии? Что лежит

воснове их патогенности?

9.Какой ученый открыл анаэробный способ существования клостри-

дий?

10.Какие продукты метаболизма клостридий имеют промышленное значение?

ЗАНЯТИЕ 15 ТЕМА: МИКРООРГАНИЗМЫ, ОСУЩЕСТВЛЯЮЩИЕ

БРОЖЕНИЕ. МОЛОЧНОКИСЛЫЕ ПАЛОЧКИ И КОККИ

Молочнокислые бактерии осуществляют брожение с образованием в качестве основного, а иногда и единственного конечного продукта – молочной кислоты. К ним относятся морфологически разнообразные представите-

ли: кокки – Lactococcus (см. рис. 16), Pediococcus, Leuconostoc (см. рис. 18); и палочки – Lactobacillus, Bifidobacterium (см. рис. 22).

Основными субстратами для молочнокислого брожения служат моносахара (в первую очередь, глюкоза) и дисахара (мальтоза, лактоза). Брожения других, более сложных субстратов проходят через путь предварительного расщепления их до глюкозы или продуктов ее превращения.

Гомоферментативные молочнокислые бактерии (табл. 2) образуют только молочную кислоту (не менее 90 %). Катаболизм глюкозы происходит по пути гликолиза до образования пирувата. Пируват служит акцептором электронов. В этом случае при участии ключевого фермента лактатдегидрогеназы 2 электрона переносятся с НАД-H2 на молекулу пировиноградной кислоты, что приводит к образованию молочной кислоты.

Таблица 2

Представители молочнокислых бактерий

Гетероферментативные молочнокислые бактерии расщепляют глюкозу по пентозофосфатному пути. В конечных продуктах присутствуют, помимо молочной кислоты, спирт, уксусная кислота и СО2. Преобладание в ферментационной среде того или иного продукта зависит от вида культуры, условий культивирования и фазы развития.

Типичные представители молочнокислых бактерий объединены в семейство Lactobacillaceae, род Lactobacillus (рис.54), в составе которого около 50 видов (L. lactis, L. acidophilum, L. bulgaricus, L. casei, L. plantarum, L. brevis). Название семейства происходит от латинского слова «лактис» – молоко.

Это длинные тонкие палочки, до 10 мкм длиной; иногда кокковидные,

ЗАНЯТИЕ 15 ТЕМА: МИКРООРГАНИЗМЫ, ОСУЩЕСТВЛЯЮЩИЕ БРОЖЕНИЕ.

в редких случаях подвижные (за счет перитрихальных жгутиков), часто образуют нити.

Факультативные анаэробы, иногда микроаэрофилы, слабо растут на воздухе. Хемоорганотрофы, растут только на богатых сложных средах. Некоторые нуждаются в витаминах, аминокислотах, пуринах, жирных кислотах. Благодаря специфическим потребностям в питательных веществах молочнокислые бактерии используются в качестве индикаторных культур при количественном определении витаминов группы В и аминокислот в питательных продуктах и препаратах для промышленного и фармацевтического производства.

Рис. 54. Бактерии рода Lactobacillus

1 – Lactobacillus delbrueckii (электронная микроскопия);

2 – молочнокислые палочки – нормальная микрофлора слизистых оболочек

Метаболизм бродильного типа. Каталазу не образуют. У них отсутствуют цитохромы и другие гемсодержащие ферменты, поэтому синтезировать АТФ за счет дыхания они не могут. Колонии не окрашенные, известковобелого цвета, небольшого размера – 2–5 мм. Бактерии могут образовывать внеклеточный полисахарид (декстран или леван). При выделении молочнокислых бактерий на твердой питательной среде в нее добавляют мел. Колонии выросших бактерий окружены зоной просветления в местах растворения мела при взаимодействии его с образующейся молочной кислотой.

Оптимальная температура – 30–40 °С. Бактерии отличаются высокой устойчивостью к рН среды и термостабильностью. Благодаря этому они могут расти в кислых средах и при относительно высокой температуре, например в силосе, кислой капусте, бродящем пивном сусле, плодах, овощах, соках, которые подлежат консервированию (L. plantarum).

Широко распространены в природе: их можно обнаружить в почве, на разлагающихся остатках животного и растительного происхождения, в молоке и молочных продуктах, пиве, фруктово-винных напитках, солениях, маринадах, пищеварительном тракте человека и теплокровных животных. Сапротрофы (за исключением отдельных видов, играющих определенную роль в кариесе зубов). В терапевтической практике широко используются при лечении дисбактериозов (препарат лактобактерин). В ассоциации с некоторы-