- •Лекция №1
- •Методы мг – направлены на изучение стр-ры генома, на физическое положение, на их функции и механизмы функционирования.
- •Физическое картирование
- •Физическое картирование у эукариот
- •2 Метод – белок-ат (вестерблот гибридизаци).
- •Метод fish – флюоресцентная in situ гибридизация.
- •Vntr- пцр – фариабельность количества повторов.
- •2 Элемент необходимый при регуляции инициации – оператор.
- •2 Базовые схемы транскр: позвоночных; растений и грибов.
- •3 Основные типа повторов:
- •Генная терапия.
- •In vivo – агент сам находит точку в которую встроится неоьходимо. При фенилкетонурии необходимо удалить весь организм! Гемофилия поддастся такому лечению.
Генная терапия.
Врожденные заболевания – лечение это снятие симптомов (дальтонизм, гемофилия – средний срок жизни – 40 лет сравнительно с 7 ранее, фенилкетонурия – правильная диета, врожденный иммунодифицит – бороться нереально). В 1995 г. в американском конгрессе врач представил девочку с врожденным иммунодефицитом (точечная мутация 1 из генов) ее собственный костный мозг был модифицирован заменили один мутантый ген на здоровый. Эксперименты по лечению – все 5 попыток были неудачны (бета галактоэмия) (эксперименты проводили в США и Великобритании), теперь эти эксперименты без клинических исследований ведутся (РФ и Феликобритания). ГТ – как перспектива.
Существует 2 основных подхода: фетальная ГТ введение чужеродной ДНК на уровне зиготы или эмбриона на самых ранних стадиях. ДНК встаривается в кл не утратившие способность к тотипатентности. Более перспективный подход. Но технические сложности присутсвуют с самого начала, как проводить введение? Какова выживаемость эмбриона? Какова вероятность приживления?
Соматическая генная терапия – введние ДНК в соматические (нужные нам кл), излечение происходит в нужном месте, но потомки не несут нормальной формы – человек становится не больным а носителем.
По воздействию зависит от того какая мутация произошла. ГТ – точечные мутации, геномные перестройки ей не подвласты.
Подход:
-
восстановление утраченной функции.
-
Подавление избыточной функции
-
Модификация организма с инфекционными или опухолевыми агентами
Возникают вопросы: в какие кл, как доставить.
Ex vivo –генная терапия по живому, но снаружи, берутся кл организма, модифицируются и встраиваются – лечение связанных с костным мозгом.
In vivo – агент сам находит точку в которую встроится неоьходимо. При фенилкетонурии необходимо удалить весь организм! Гемофилия поддастся такому лечению.
ГТ зародышевых клеток – пересадка зародышевых кл, которые вытесняют больные кл, замещают собой. Технические проблемы – чьи зародыши использовать (пуповинная кровь – источник стволовых кл), процесс пересадки зародышевых кл еще пока не отлажен.
Как доставить ген: необходимо защить молекулу ДНК и обеспечить ее транспорт до генома, в качестве варианта – ретровирусы, могут проникнуть в клетку, преодолев иммунную систему и встроиться в геном
Осуществляется в е.коли. затем берут плазмиду, транскрибируют ее и получают вирусную РНК, упаковку осуществляет упаковочная кл – находится норм форма ретровируса, синтезирующие капсид. Получ ретровир частицу с модиф РНК, сод нужный ген. Они встраивв стволовые кл крови, фибробласты, гепатоциты. Достоинства – непатогенен; ретровирусы встраиваются в геном в некодирующую часть генома; биология хорошо изучена; простое манипулирование. Отрицательные – низкие титры образования; ограниченная емкость внедрения 10 кб; не инфицируют неделящиеся клетки; экспрессия трансгена мб непродолжительной; не очень хорош для in vivo терапии – экспрессия нестабильна, т.к. перестройка негома с неавадеванием ДНК.
Аденовирус.
Принцип образования вектора такой же. Поражают –печень, эпителий дыхательных путей, кл миелопоэза. Есть непатогенные дефектные мутанты. Человек природный хозяин. Очень высокие титры – упаковка идет очень активно. Хорошо просачивается в природного хозяина через иммунную сисетму – до клеток; инфицирует как делящиеся так и неделящиеся кл; легко манипулировать – биология хорошо изучена, существуют паковочные клеточные линии
Проблема: не интегрирует в геном – стабильность низкая, работать сложнее, обмен информации с другими аденовирусами.
Аденассоциированне вирусы – для своего жиз цикла необходимы аденовирусы, не содержат ДНК- полимеразу, легко детектировать, проще чем у аденовирусов построение вектора, но ограничены кл в котрые встраиваться: фибробласты, эпите кл. малая емкость, низкая инфек активностьЮ для инфекции необходим аденовирус, низкие титры, поведение внутри генома человека плохо изучены.
Герпес-вирусы – способны встраив в неделящиеся и недифференцированные кл. есть готовые системы позволяющ не создавать предшествие. Спектр кл-хозяев велик, высокая емкость, высокие титры, хорошо изучена биология, но низкая эффективность упаковки, дефектные мутанты могут оказаться цитотоксичны, векторные конструкции сложно создавать и регулировать.
? о встраивании прямой ДНК. 2 проблемы: доставить ДНК в кл и встроить ее в геном, доставка необходимо упаковать ДНК или РНК вирус – окружена оболочкой и защищает от нуклеаз. Для растений используется бомбардировка молек ДНК прикрепленными к коллоидному зонду. 2 метод для эукаритотических кл -невысокая выживаемость – электропорация – кл эукар смешив с раствором ДНк и подвергаю действия 2 кВ. При воздействии на эмбпиональные кл – невозможно.
Упаковывать ДНК для терапии в липосомы. Проблема: ДНК линейная – необходимо встроить в геном иначе она не переживет, для этого используются случайная или незаполненная рекомбинация. Необходимо сделать сайт-специй рекомбин и необх вводить новые интегразы.
Регуляция? использовать ихтиары? Сильные промотеры регуляции не поддаются. Как проконтролировать процесс гетерохроматизации. Как добиться пожизненного существования экспрессии.
Применение ГТ: изучение врожденных заболеваний; противоопухолевая терапия – онкотрансфор заболевание генома; повыщение антиопухолевой активности кл иммунной системы, путем внесения в опухолевые кл цитокинов.
Лечение онкозаболеваний:
-
Введение в опухолевые кл чужеродные ДНК, стимуляция имун ответа
-
Введение цитокинов.
-
Введение цитотоксинов или генов, кодирующих белки принудительно вкл апоптоз.
-
Блок экспрессии онкогенов мини АТ в онкгенам или антисмысловая РНК – интенференция – плохо изучена
-
Восстановление белков-триггеров
-
Усиление хозяина (устойчивость к лекарствам)
-
Можификация имеющихся – антисмысловая РНК, введение генов, кодирующих токсины
Т.о. ГТ очень перспективна, появилась идея лечения инфекции заболеваний с помощью ГТ, особый интерес к ВИЧ. 1% населения земли европиоидов, полностью устойчивых в ВИЧ. ВИЧ связы в рецепт к Т-хелперов, 2 изоформы – гомозиготы по мутантной формы устойчивы, у гетерозигот заболевание протекает быстрее.