Физическое картирование

1 этап – построение рестрикционной карты, используя маркер интересующего фрагмента, можно определить его физ положении в карте рестрикции. Выделяем хромосомную ДНК бактерий, с помощью плазмиды. Выделенная ДНК д.б. чистой. Обрабатывают рестриктазами, чем больше тем более полная карта. Если используем 3 варианта, то используют 3 попарных варианта.

Определить на каком фрагменте лежит интересующий нас маркер – саузерн-блот гибридизации. На 1 этапе происходит разрезании геномной ДНК рестриктазой и разделение получившихся фрагментов на агарозном геле. Перенести рестрикционные фрагменты на носитель – нитроцеллюлозный фильтр. Перед переносом необходимо фрагменты ДНК денатурировать – можно 2 сп-ми: замочить исследуемы гель в растворе щелочи, фарез в денатурирующих условия с формальдегидом (распиратор).

Переносим на фильтр: в тазик ставим платформу, ладем фильтровашку концами ко дну тазика, далее гель, нитроцеллюлозный фильтр, фильтроватьная бумага, груз, в тазик наливаем буфер для переноса. Буфер по в фильтровальной через гель на полотенца (фильтров) и идет ток жидкости и выносят ДНК, которые застревают в фильтре.

2 – памрес, вырезается кусок по размеру с гелем и вместо полотенец кладется. Время около ночи.

Гель можно поместить в камеру с электродами – часа 3.

Молекулы ДНК дополнительно закрепляют на нитроцеллюл фильтре – обработка УФ. Берем маркерный участок, метим фрагмент или флюорисцентной меткой или радиоактивной (прикрепит молекулу, содержащую изотоп или нуклеотиды, вставить во время синтеза). Д енатурируем фрагмент, смешивает с буфером для гибридизации и помещаем нитроцеллюлозный фильтр в раствор буфера, в котором находится маркер. Необходимо учит температуру.

Если к маркеру есть комплимент ДНК и образуют двойную связь. Чтобы не свзявалось с самой нитродец к маркеру добавляют другую ДНК. Заем вынимают фильтр и подносим к нему УФ светится все – необходимо отмыть – батарея буферов. Далее фильтр смотрят через ренгеновскую пленку, если слабая метка -сушим. Если сильна метка время экспозиции 12 часов, на экспозициюболее 2 недель бессмысленно.

Физическое картирование у эукариот

Включает большое количество методов. Ген- мышечной дистрофии Дюшенна(mdm) – потеря мышечной массы и смертность, болеют только мужчины, передача происходит только мужчинам и происходит через женщину (редко болею). Повреждении наследственно информации (геном), ген сцеплен с Х –хромосомой.

Необходимо определить в каком плече Х-хромосомы, у женщин наблюдалась транслокация (цитогенетический метод). Необходимо было определить точку разрыва и было сделано предположение, что связанная с 28S RNA. Использовали саузерн блот гибридизацию.

Больше сайтов рестрикции и происходит не полное разрезание. Необходимо определять количество получаемых объектов: N=ln(1-P)/ln(1-1/L).

Доказали, что фрагменты с которыми гибридизируется маркеры фрагмент располагается с точкой разрыва. Нам интересен участок, который располоден в хрмосоме рядом с локусом. Для выделение использование соматических клеточных гибридов.

Соматический клеточный гибрид. Берем 2 клети, сливаем их – образ гетерохорион – 2 ядра – способны к делению и они могут передаваться другому поколению. В зависимости от стабильности 1 из клеток происходит утрата хромосом. Мы можем получить набор хромосом от1 клетки и 1 хромосому от другой клетки. Панели – коллекции линий, в которых есть определенные хромосомы.

Образование панелей, содержащую отдельную строгоорганизованную хромосому. Необходимо определить ген, который соседствует на реальной хромосеме, для этого используют банки генов. Банки генов.

Берем интересующий фрагмент генов прокариты-1 хромосома, эукар – интересующая хром из панели; режем ее на отдельные фрагментами рестриктазами – анализу подлежит плохо. Фрагменты должны обновляться и необходимо их упорядочить –патологизировать и для этого их помещают в векторы.

1 вектор-плазмидный –небольшая молекула ДНК-нехромосомная часть генома, использ бактериями для дополнительных признаков. В хромосоме есть ориджин репликации и транскриптон –именно туда можно поместить наш фрагмент. Смешиваем порезанный вектор с порезанными фрагментами и легируем. Получ смесь несущие плазмидный фрагмент и не несущие. Клетки бактерий можно трансформировать бактериями. И высеить клетки е коли. И получилось, что мы информацию. Клетки содер плазмиду передают ее по наследству, мы можем копировать плазмиду – исследуемый фрагмент.

2-вектор фаг-лямбда. Вставки в плазмидах 10 тпн – но очень врядли, потолок 3 килобазы (3тпн). У фагов значительно выше емкость до 20 тпн.

Дополнительные бактериофаги -100тпн. И космидные векторы- гибрид фага и плазмиды. Исследование дрожжей показало, что дрожжи так же обладают способностью хранить геном 1000 тпн. Используют бактериальные искусственные хромосомы 300 тпн, искусств хромос млекопит 1000 тпн. Наиболее стабильный плазмиды, лямбда и космиды.

1 путь. Необходимо узнать в каком клоне живет наш фрагмент. Высаживает бактерии на ПС, накладываем нитроцел фильтр и отстается след. Денатурацию ДНК, отмывание с помощью щелочи мембраны и смешивают с радиактивным зондом (СБ - гибридизация), отмывают от избытка зонда. Пятно засветки анализируют.

2 путь.

Взяли х хромосому из соматич гибрида здорового человека и взяли ДНК больного. Нормальную ДНК-трейсер, порезали рестриктазой сал3а и получили фрагменты с липкими концами и взяли в избытке ДНК больного – трайвер и не расщепили другим способом – ультразвуком и получили тупые концы. ДНК получ денатерировали и смешали трайвер в избытке. ДНК драйвера ренатурируют между собой и образ тупые концы, ренатру и с ДНК трейсера –образ полутупые концы и те фрагм трейсера и драйвера, чаще будут денатуриовать. Липки концы совпадающих фрагментот будут в низкой концентрации. Ренатур только между собой трейсеры, у которых есть те фрагменты, который нет в трайвере.

Вектор резали с образованием липких концов. Неинтересующ фрагменты в клонирование не пойдут т.к. липких концов нет.

Неоходимо создать болк хромосомы – метод прогулка по хромосоме.

Взяли клон, который гибридизуется с соседней РНК и определили его последовательность и создали на базе сиквенса вледующий зонд, выявили клон, с которым гибридиз оба клона. На базе самой длинной гибридизуем 2 и 3 зонды. Бурут самые длинные и так делают до самого последнего.

Делитированный фрагмент составляет 100тпн – сравним с бактериальным геномом.

Взяли ДНК у различных животных (приматы). И использовали зонд, выделенный из человека – явление зооблота. Решили провести напрямую гибридизацию с молекулой РНК, он разогнали суммарную РНК человека в денатур и провели гибридиз с ДНК зондом, который они выделили. Т.к гибрид РНК-ДНК назвали нозерн –гибридизация. Получена огромная мРНК –самый крупный ген. В нем насчитытвается 79 экзонов и его длина около 200тпн. Так был картирован первый ген.