1.2.2 Диагностика хеликобактерной инфекции

Helicobacter pylori был выделен и описан австралийскими учеными Уорреном и Маршаллом в 1983г. [366]. Они доказали его роль в формировании гастродуоденальной патологии. К самостоятельному роду Н.pylori был отнесен в 1989г. на основании данных ультраструктуры, биохимических, антигенных свойств и генотипических признаков [50]. Поскольку он выделен относительно недавно представляется целесообразным дать краткое описание его свойств и методов его изучения.

H.pylori - мелкие, неспорообразующие, грамотрицательные, оксидазо- и каталазо-положительные, продуцирующие большое количество уреазы, микроаэрофильные бактерии изогнутой, S-образной или слегка спиральной формы. Толщина клетки бактерии 0,5—1,0 мкм, длина 2,5—3,5 мкм. Клетка покрыта гладкой оболочкой, на одном из полюсов имеет 1—6 мономерных жгутиков длиной 5-10 мкм. [12, 86]

Геном H.pylori невелик - 1600 генов [352]. Содержание гуанина и цитозина в ДНК - 35-37 мол %. По этому признаку он дифференцируется от кампилобактеров. В их ДНК % ГЦ оснований составляет 31-32 [86].

Существующие в настоящее время методы диагностики хеликобактерной инфекции могут быть разделены на две группы - инвазивные и неинвазивные. Инвазивные методы предусматривают проведение эндоскопического исследования с отбором биопсийного материала [144]. Следует отметить, что методики, базирующиеся на эзофагогастродуоденоскопии, подвержены случайностям из-за неравномерного распределения клеток H.pylori по гастродуоденальной слизистой. Для предотвращения ложноотрицательных результатов используют множественную биопсию. При этом соскобы делают не только в антральном отделе, но и в теле желудка. Рекомендуется брать биоптаты в 5-7 участках. [231]

К неинвазивным методам диагностики хеликобактериоза относятся иммунологические исследования, позволяющие определять наличие антител в сыворотке крови, а также уреазные дыхательные тесты и «аэротест» [111]. По поводу неинвазивности иммунологических методов можно дискутировать, так как для них необходим отбор крови. Эти методы используются, главным образом, в эпидемиологических исследованиях с целью изучения распространения инфекции, ассоциированной с H.pylori.

Бактериологический метод.

Бактериологический метод заключается в выделении чистой культуры H.pylori из биоптатов, желудочного сока и дальнейшего ее изучения. Бактерии растут в микроаэрофильных условиях при составе газовой смеси: азот - 85-87%, кислород - 5%, углекислый газ - 8-10%. В аэробных и строго анаэробных условиях хеликобактер не растет. Оптимальная температура 37°С. Многие штаммы H.pylori развиваются при температурах: 33-35° С и 40­41° С, но не растут при 25-28°С и 42°С и выше. Н. pylori культивируют на богатых питательных средах - средах с добавлением крови, "шоколадном агаре" и других (Колумбия-агар, среда Мюллер-Хинтона). На плотной питательной среде через 48-72 часа образуются прозрачные мелкие колонии диаметром 1мм. В жидкой среде рост не заметен, для культивирования требуется постоянное перемешивание [86]. Бактериологическое исследование позволяет определить морфологические, культуральные, биохимические, антигенные свойства, антибиотикорезистентность и факторы патогенности хеликобактера. Для проверки эрадикации H.pylori повторный посев производится через 4 недели после завершения лечения.

Бактериологический метод имеет 100% специфичность [264]. Чувствительность от оснащенности лаборатории и квалификации персонала. H.pylori «капризен», требует специальных условий культивирования, дорогостоящего оборудования и сред для транспортировки и культивирования. Все это делает бактериологический метод детекции хеликобактера малодоступным для практических лабораторий.

Морфологические методы.

Эти методы получили наиболее широкое использование в практике. К ним относятся изучение парафинизированных срезов (гистологический метод) и микроскопия мазков отпечатков (цитологический метод).

Гистологический метод выявления H.pylori ряд авторов считает «золотым стандартом» диагностики хеликобактериоза. Его специфичность составляет 81-97%, чувствительность - 72-100% [4, 34, 70]. Производится прямая визуализация микроорганизма. Специальные окраски: серебрение по

Вартину-Старри, окрашивание по Гимзе, Генте, Граму, акридиновым оранжевым, толуидиновым синим повышают вероятность микроскопической идентификации. Метод имеет ряд преимуществ, таких как широкая доступность, удобство хранения и транспортировки препаратов, возможность оценки состояния слизистой оболочки желудка. Наиболее точная картина поражения получается при изучении не менее 5 биоптатов. Содержание H.pylori в препаратах можно оценить количественно.

Минусом теста является его субъективность. Приходится на глаз отличать кокковую форму хеликобактера от кокковых форм других бактерий и другие спиралевидные микроорганизмы от H.pylori. Ограничения гистологического метода связаны с этапом отмывания биоптата. Небрежность на этой стадии влечет занижение концентрации H.pylori при оценке обсемененности, а при исходно низком содержании бактерий - к получению ложноотрицательного результата [55]. Кроме того, гистологический метод продолжителен, только подготовка препаратов к исследованию занимает 5-7 дней. Для проведения гистологической диагностики хеликобактериоза требуется квалифицированный персонал с большим опытом морфологических исследований.

В начале 90-х годов было предложено использовать микроскопическое исследование мазков отпечатков биоптатов, окрашенных по Грамму в качестве простого, быстрого (5 мин) способа диагностики хеликобактерной инфекции [3, 130]. В настоящее время этот метод один из основных при выявлении хеликобактера в практических лабораториях. Значительное преимущество цитологического метода заключается в том, что им регистрируется более высокая обсемененность слизистой оболочки H.pylori, чем в гистологическом исследовании. Это обусловлено меньшими потерями инфекционного агента на стадии подготовке препарата [54].

По способу получения препарата различают ряд вариантов метода: - «crush cytology» — раздавливание биоптата;

• «touch cytology» («imprint cytology») - прикосновение и отпечаток люминальной поверхности биоптата к предметному стеклу;

• «brush cytology» - получение препарата пристеночной слизи.

Выявление H.pylori цитологическим методом в желудочном соке, полученном натощак, имеет низкую чувствительность и специфичность, поэтому в настоящее время не применяется [27].

Проведенные исследования выявили, что «brush cytology» является наиболее приемлемым вариантом морфологической диагностики H.pylori- инфекции. Метод прост, недорог, имеет высокую чувствительность. Он особенно эффективен при низкой обсемененности и при контроле эрадикации H.pylori [56]. Чувствительность этого варианта составляет 80­90%, а специфичность по мнению отдельных исследователей может достигать 100% [41].

Главным недостатком цитологического метода, как и гистологического, является субъективность, в связи, с чем достижение 100% специфичности представляется маловероятным.

Быстрый уреазный тест.

H.pylori — уникальный продуцент уреазы. Поэтому, ряд методов его выявления основан на определении активности этого фермента. Для быстрой детекции хеликобактера биоптат помещают в среду с мочевиной и индикатором. При наличии уреазы из мочевины образуется аммоний, что меняет рН среды и цвет индикатора. Тест корелирует с результатами выделения чистой культуры H.pylori, совпадение отмечается более чем в 90% случаев [73]. Он прост, не требует особой квалификации медицинского персонала, относительно дешев, позволяет быстро получить ответ. Чувствительность теста составляет 65-95 %, а специфичность — 75-100 % [34, 73]. Недостатком быстрого уреазного теста является высокая вероятность ложноположительных результатов, что может быть связано с контаминированием материала другими уреазопродуцентами. При малом количестве H.pylori возможен ложноотрицательный результат, поскольку изменение окраски происходит через несколько часов.

Уреазные дыхательные тесты.

На уреазной активности H.pylori также основаны изотопные методы диагностики - дыхательные тесты с мочевиной, меченной изотопами углерода ¹³С, ¹⁴С. Меченая мочевина дается пациенту в составе пробного завтрака. При разложении мочевины уреазой выделяется углекислый газ, содержащий изотоп углерода. Газ с кровотоком доставляется в легкие и выводится при выдохе. На основе анализа изотопного состава выдыхаемого воздуха, делают заключение об инфицированности H.pylori [39].

Работа с радиоактивным изотопом углерода ¹⁴С ограничена и строго контролируется, поэтому этот вариант метода используется редко. Дыхательный тест, с мочевиной, меченной нерадиоактивным изотопом ¹³С, нашел более широкое применение [63]. Дыхательные тесты объективны - не зависят от правильности забора материала, интегративны - дают представление о всей слизистой оболочке, а не об отдельном ее фрагменте. Поэтому в странах, где освоена эта методика, она рекомендуется для контроля эффективности эрадикации H.pylori, эпидемиологических исследованиях больших контингентов населения, обследования детей.

1 о

Изотоп "СО. выявляется масспектрометром. Высокая стоимость этого прибора ограничивает внедрение ^,3С дыхательного теста. Имеются варианты регистрации ¹³С02 с использованием лазерной технологии [28].

Основным недостатком этого теста индикации H.pylori является высокая вероятность получения ложноположительного результата, обусловленная наличием в пищеварительном тракте других бактерий, продуцирующих уреазу

Серологический метод.

Проникновение H.pylori в организм вызывает системный иммунный ответ. В сыворотке крови пациентов обнаруживаются антитела классов М, G, А, направленные против различных бактериальных антигенов хеликобактера.

Среди методов серологической диагностики Н.ру1оп наиболее широкое распространение получил ИФА [78, 264]. Одно из его преимуществ — определение факта инфицирования не только при манифестной, но и при субклинической форме инфекции и на стадии ремиссии заболевания. Чувствительность метода 87 - 98%, специфичность - 75 - 100% [74, 86].

Серологический метод может дать ложноположительные и ложноотрицательные результаты [73]. Они объясняются следующими причинами:

-за счет трансплацентарной передачи антител серопозитивными могут оказаться неинфицированные Н.ру1оп новорожденные;

-серопозитивность может быть при узелковой гиперплазии слизистой оболочки желудка и отсутствии возбудителя;

• тест на антитела отрицателен 18-60 дней с момента заражения до развития гуморального ответа;

• тест на антитела положителен в течение месяца после эррадикации возбудителя.

Наличие антител к Н.ру1оп в крови не свидетельствует однозначно об активной хеликобактерной инфекции. Только количественный вариант иммуноферментного анализа и сравнение уровня антител после лечения с исходным уровнем, позволяет сделать определенные выводы. Однако, следует учитывать, что через 6 недель после завершения лечения уменьшение титра антител к Н.ру1оп наблюдается и при успешной терапии, и при персистировании инфекции. Информативным считается падение титра антител более чем на 50% через 6 месяцев после окончания терапии [354]. Полугодовое ожидание результата лечения, сложность организации отбора и хранения двух проб крови, меньшая доступность количественных методов ИФА не позволяют рекомендовать этот метод для контроля эррадикации Н.ру1оп. ИФА может быть использован при проведении эпидемиологических исследований. Его применение в клинической практике определяется индивидуально в конкретной ситуации.

Разработаны «настольные» тесты для обнаружения антител к H.pylori. Они основаны на латекс-агглютинации или твердофазном ИФА. Исследуется капля крови, взятая из пальца. Результат теста читается через 1-2 минуты, дополнительного оборудования не требуется. Несмотря на уникальную простоту выполнения, место этих методик в диагностике H.pylori-инфекции пока не определено. Возможно, они найдут применение в небольших больницах или амбулаториях, где потребность в иммунологической диагностике ограничивается единичными анализами [60].

Имеются методики определения антител к H.pylori в слюне и в кале, возможности их использования для целей практической диагностики интенсивно изучаются [213].

Полимеразная цепная реакция.

В диагностике хеликобактерной инфекции активно используются молекулярно-биологические методы исследования. В основном они представляют собой различные модификации ПЦР, позволяющие обнаружить специфичные для Н. pylori гены (16SpPHK, UreA, UreB, UreC, CagA, VacA и др).[141, 332]

Для диагностики инфекции, ассоциированной с H.pylori, метод ПЦР был впервые применен в 1990г. Hoshina и др. В своей работе авторы сконструировали праймеры к высококонсервативному видоспецифичному гену H.pylori 16SpPHK [141]. В дальнейшем многие исследователи также использовали последовательность этого гена для выявления хеликобактера [337,351].

В ряде других работ для выявления H.pylori использовались праймеры к генам иге, кодирующим различные субьединицы уреазы [110, 143]. Создана ПЦР тест система для выявления хеликобактера, основанная на принципе «Nest-PCR». Мишенью является высококонсервативный ген Hsp60 белка теплового шока. Новая система показала преимущества в чувствительности и специфичности перед ПЦР на 16S rRNA ген, ureC ген [334]

Метод ГТТДР позволяет выявлять возбудителя хеликобактерной инфекции как в образцах биолтатов слизистой желудка и двенадцатиперстной кишки, так и в желудочном соке, желчи, слюне, содержимом зубных карманов, фекалиях, что делает этот метод весьма привлекательным для практических исследований [238, 255, 256, 334, 339, 375].

Кроме этого, метод ПЦР незаменим в научных исследованиях H.pylori. Он дает возможность типировать и дифференцировать штаммы, проводить эпидемиологические исследования инфекции, отличать случаи реинфекции от рецидива инфекции, определять механизмы антибиотикорезистентности [161, 274]. Методом ПЦР было показано, что устойчивость H.pylori к макролидам обусловлена точечной мутацией в 23SpPHK гене [100, 251]. Разработана мультиплексная тест-система, основанная на «Real time PCR» и измерении температуры плавления ампликона, для выявления пациентов, инфицированных H.pylori, определения мутаций устойчивости к кларитромицину и детекции генов факторов патогенности H.pylori cagA и vacA [101].

Показана возможность выявления H.pylori методом ПЦР в объектах внешней среды - сточной воде и питьевой воде. В США разработаны тест системы на основе «Real time PCR», одна с использованием интеркалирующего агента Sybre Green [280], вторая с использованием праймеров TaqMan [328] в 100 раз чувствительней обычной ПЦР. Они способны выявлять 2-28 клеток H.pylori в пробе, в том числе и некультивируемые, но жизнеспособные формы микроорганизма. При исследовании 23 образцов сточных вод в 84 % из них был выявлен H.pylori, параллельно при использовании традиционного варианта ПЦР получены отрицательные результаты [280].

В сравнительных экспериментах установлено преимущество метода ПЦР над иммуногистохимическим методом в чувствительности и специфичности при диагностике хеликобактерной инфекции [370].

Французские исследователи на 518 пробах биоптатов провели выявление

8. pylori гистологическим методом и методом ПЦР. Чувствительность и специфичность для ПЦР составила 98.2 % и 97.5 соответственно, а для гистологического метода - 87.7 % и 91.3 % [345].

Учитывая малую вероятность широкого внедрения микробиологического исследования в практическую диагностику хеликобактерной инфекции, можно расценивать ПЦР как наиболее перспективный, эффективный и доступный из методов специфической детекции хеликобактера. В связи с этим, представляется крайне актуальным и важным освоение, оптимизация и активное внедрение в работу практических лабораторий методов диагностики H.pylori-инфекции, основанных на технологии ПЦР.