Материалы и методы исследования
Эксперименты проводили на белых крысах-самцах линии Вистар разного возраста (зрелые - 12 мес. и старые – 24 мес.).
Для эксперимента использовались 4 группы животных (по 2 возрастных подгруппы в каждой группе) (n=5):
группа 1 – контроль: введение физ. раствора по 1 мл подкожно 3 раза;
группа 2 – введение даларгина в дозе 600 мкг подкожно 3 раза в течение дня;
группа 3 – стресс-контроль: иммобилизационный стресс в тесных пластиковых трубках на 12 ч;
группа 4 – стресс (см.выше) и введение даларгина в дозе 600 мкг подкожно 3 раза в течение дня до начала стресса.
Опытные группы животных декапитировали через 6 часов после окончания стрессового воздействия. Контрольные группы забивались через 18 часов после последнего введения препарата или физ. раствора.
Исследованы гомогенаты тканей (печень и головной мозг) крыс на содержание МДА и каталазы. Гидролизат крови исследовался на содержание каталазы.
Статистическая обработка данных проводилась с использованием критерия Стьюдента Анализ проведен с использованием программ “Биостатистика” (v. 4.03 © Stenton Glanz, перевод на русский язык “Практика”, 1998) иMS Excel’97.
Приготовление гомогенатов
Гомогенат тканей готовился из расчета 100 мг ткани на 2 мл физиологического раствора (для головного мозга и печени). Гомогенизирование в течение 4 минут при охлаждении.
Реактив: раствор NaCl 0.9% (физиологический раствор).
Приборы:гомогенизатор MPW-309, весы торсионные ВТ до 500мг, пинцеты, бумага фильтровальная.
Методика определения мда Реакция с тиобарбитуровой кислотой (тбк-тест)
Принцип метода: гидроперекиси при инкубации при t=90-100оС разлагаются до конечного продукта – МДА, который, в свою очередь, образует с тиобарбитуровой кислотой устойчивый окрашенный комплекс, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации МДА и может определяться спектрофотометрически. (Федорова Т. Н. и др., Реакция с ТБК для определения малонового диальдегида крови методом флуоресценции // Лаб. дело, 1983, №3, с. 25-27.)
Реактивы: трихлоруксусная кислота (ТХУ) 10%, тиобарбитуровая кислота (ТБК) 0.8%.
Приборы и посуда: центрифуга MPW-310, спектрофотометр СФ-46, водяная баня, центрифужные пробирки (5 мл) из стекла и пластмассы, пробирки стеклянные (15 мл), пробки резиновые двухсторонние, пипетки (1 и 2 мл), кюветы спектрофотометрические с толщиной слоя 10 мм.
Ход измерения. В центрифужную пробирку помещаются 2 мл гомогената ткани либо гидролизата крови. К содержимому пробирки добавляется 1 мл 10% трихлоруксусной кислоты. Смесь центрифугируют 15 минут при 3 тыс. об/мин для осаждения белка (осадок идет на биуретовую реакцию (см. методику)). 2 мл супернатанта забирается в длинные пробирки для инкубирования, 0.5 мл может использоваться в определении средних молекул (см. методику). В контроле используется 2 мл дистиллированной воды. Во все длинные пробирки, включая контроль, добавляется по 1 мл 0.8% ТБК. Пробирки помещаются на кипящую водяную баню на 10 минут. При наличии мути после инкубации содержимое пробирки дополнительно центрифугируют 10 мин при 3 тыс. об/мин. Полученные пробы спектрофотометрируют на 2 длинах волн: 535 нм и 450 нм (применяется лампа накаливания, ширина щели 0.5) – против контроля.
Расчетсодержания МДА по оптической плотности:
