Министерство здравоохранения Российской Федерации

Государственное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«Тверская государственная медицинская академия Росздрава»

Кафедра физики измерение концентрации оптически активных веществ с помощью поляриметра

Методические указания для лабораторной работы № 13

(для фармацевтического факультета)

Тверь 2008

Методические указания составлены кафедрой медбиофизики ТГМА и предназначены в помощь студентам фармацевтического факультета при подготовке и выполнении лабораторной работы.

Методические указания подготовил

Туровцев В.В.

Лабораторная работа № 13

ИЗМЕРЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ОПТИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ С ПОМОЩЬЮ ПОЛЯРИМЕТРА

ЦЕЛЬ РАБОТЫ:

1. Изучить явление поляризации света и его применение для исследования оптически активных веществ.

2. Освоить метод определения концентрации растворов оптически активных веществ с помощью поляриметра.

3. Определить концентрацию оптически активного вещества.

ПРИБОРЫ И ПРИНАДЛЕЖНОСТИ: поляриметр, кюветы с растворами оптически активных веществ, осветитель.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Ремизов А.Н. Медицинская и биологическая физика. М.: Высшая школа, 1999. (см. Глава 25).

2. Ремизов А.Н., Максина А.Г., Потапенко А.Я. Медицинская и биологическая физика. М.: Дрофа, 2003. (см. Глава 20).

3. Лекции по теории вероятности и математической статистики (II семестр).

4. Морозов Ю.В., Основы высшей математики и статистики. М.: Медицина, 1998. (см. п. 9.4).

5. Павлушков И.В. и др., Основы высшей математики и математической статистики. М.: Геотар-Мед., 2003. (см. п. 8.2.2, 8.2.3).

КРАТКАЯ ТЕОРИЯ

Свет - это электромагнитные волны с длиной волны от 380 нм до 760 нм. В электромагнитных волнах направления вектора напряженности электрического поля , вектора индукции магнитного поля и вектора скорости распространения волны расположены перпендикулярно друг другу. Химическое и биологическое действие света связано с электрической составляющей электромагнитной волны и её действием на заряженные частицы. Сила, действующая со стороны электрического поля на электрический заряд и вызывающая его смещение, пропорциональна и сонаправлена с вектором напряжённости.

Распространение света можно рассматривать, как электромагнитное поле, распространяющееся в пустом пространстве или возмущение, распространяющееся в электромагнитном поле, так и в виде взаимодействия множества элементарных атомных излучателей (осцилляторов). Каждый осциллятор, получив квант энергии, переходит в возбужденное состояние. Спустя очень короткий отрезок времени он возвращается в основное состояние с излучением энергии в виде электромагнитной волны. Электромагнитные волны от множества осцилляторов представляет собой совокупность случайных обрывков (цугов), и, следовательно, общая волна содержит набор беспорядочно ориентированных направлений вектора , лежащих в плоскостях, проходящих через направление светового луча. Такой луч света называется естественным (неполяризованным). Луч света, в котором все вектора лежат в одной плоскости, называется плоскополяризованным. Плоскость, проведенная через вектор и направление распространения , называется плоскостью колебаний поляризованной волны или плоскостью поляризации (рис. 1).

Существуют тела (поляризаторы), после прохождения которых естественный луч света становится поляризованным. Механизм поляризации естественного света поляризатором можно представить следующим образом (рис. 2). Каждый вектор напряженности в естественном луче можно представить по правилу параллелограмма как сумму двух взаимно перпендикулярных составляющих и . Составляющая , совпадающая с плоскостью поляризации поляризатора (главной плоскостью кристалла), им пропускается, перпендикулярная составляющая поглощается. Плоскостью поляризации поляризатора называется плоскость, в которой поглощение вектора напряженности наименьшее. Таким образом, после прохождения поляризатора интенсивность естественного света уменьшается в два раза.

Рис. 1

Расположение векторов , и и плоскости поляризации

Рис. 2

Расположение векторов , и

Явление поляризации также происходит при двойном лучепреломлении света, и обусловлено особенностями распространения электромагнитных волн в анизотропных средах. Оно состоит в том, что световой луч, преломляясь на границе некоторых естественных кристаллов (исландский шпат, турмалин и др.), разделяется на два различных по скорости распространения, но одинаковых по интенсивности луча: обыкновенный и необыкновенный. Оба луча поляризованы во взаимно перпендикулярных плоскостях. У таких лучей относительные показатели преломления разные, и, иногда говорят, что для обыкновенного законы преломления выполняются, а для необыкновенного не выполняются. Принцип действия поляризаторов основан на устранении одного из лучей, например, в призме Николя (николь).

Плоскополяризованный свет можно получить с помощью поляроидных пленок из герапатита (мелких кристаллов, закрепленных на целлулоидной пленке). Герапатит и подобные кристаллы обладают свойством дихроизма: наряду с двойным лучепреломлением они способны поглощать один из лучей значительно сильнее. Поляризация света имеет место при отражении и преломлении света прозрачными изотропными средами, при двойном преломлении света в естественных кристаллах и искусственных пленках (поляроидах), при прохождении света через мутные среды и пр.

Человеческий глаз реагирует только на интенсивность электромагнитного излучения и не может различить поляризован ли луч или нет. Если естественный свет падает на поляризатор и далее на экран (или глаз), то, вращая поляризатор, мы не заметим никакого изменения интенсивности света на экране (глазом). Наблюдаемая картина изменится, если между поляризатором и экраном поместить еще один поляризатор, называемый анализатором. При вращении анализатора в плоскости, перпендикулярной направлению луча, интенсивность светового пятна на экране изменяется от нуля до максимума. Таким образом, для определения ориентации плоскости поляризации электромагнитного излучения, требуется два поляроида (поляризатор и анализатор).

Закон изменения интенсивности поляризованного света, прошедшего анализатор, в зависимости от взаимной ориентации плоскостей поляризации поляризатора и анализатора называется законом Малюса:

. (1)

Здесь I – интенсивность света, прошедшего через анализатор [Вт/м ²]; I₀ – интенсивность света, прошедшего через поляризатор и упавшего на анализатор [Вт/м ²]; φ – угол между плоскостями поляризации поляризатора и анализатора.

Поляризованный свет применяется при исследовании оптически анизотропных элементов различных структур, в частности, тканей организма. Во многих случаях при этом возможно установить расположение и строение их элементов, которые не выявляются при микроскопировании в естественном свете. Оптическая анизотропия наблюдается у мышечных, соединительно-тканных и нервных волокон, а также у мицелл в мякотной оболочке нейрофибрилл. В микроскопии биологических объектов для этих целей применяется поляризационный микроскоп.

В природе существуют вещества, способные поворачивать плоскость поляризации плоскополяризованного света, которые называются оптически активными. Таким свойством обладает кварц, а также некристаллические вещества: скипидар, раствор сахара в воде, пары камфары. Для растворов этих веществ установлен закон зависимости угла поворота плоскости поляризованного света от концентрации оптически активного вещества, лежащий в основе поляриметрии:

, (2)

где C - концентрация оптически активного вещества, l - толщина слоя раствора, [₀] - коэффициент пропорциональности (удельное вращение), имеющий смысл угла поворота плоскости поляризации плоскополяризованного света при прохождении столба жидкости единичной концентрации и единичной длины. Величиной удельного вращения называют увеличенный в 100 раз угол вращения для столба раствора длиной 1 дм при концентрации вещества 1 г на 100 мл раствора при температуре 20 ^оС и длине волны света λ = 589 нм. Его величина приблизительно обратно пропорциональна квадрату длины волны света и зависит от температуры и свойств растворенного вещества.

Метод поляриметрии основан на зависимости угла поворота плоскости поляризации от концентрации оптически активного вещества. Он широко используется в медицине и биологии, в клинической практике (например, для определения оптической активности сывороточных белков с целью диагностики рака, для количественного определения содержания сахара в моче – сахариметрия и т.д.).

Используя различные светофильтры, можно определить величину удельного вращения и найти зависимость удельного вращения от длины волны (дисперсию оптической активности). Поляриметрию применяют также как метод исследования структурных превращений, в частности в молекулярной биофизике, т.к. при изменении конформации большинства биологически активных молекул (белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов и т.п.) изменяется удельное вращение. Т.е. по величине удельного вращения можно определить равновесную конформацию вещества в данных условиях.

УСТРОЙСТВО И ПРИНЦИП ДЕЙСТВИЯ ПОЛЯРИМЕТРА

а б

Рис. 3

а- внешний вид поляриметра, б - устройство поляриметра (назначение частей, отмеченных цифрами см. в тексте)

Рис. 4

а б в

а, в –поляриметр не настроен, б – положение, при котором производят отсчет угла поворота.

Основными частями поляриметра являются поляризатор и анализатор. Поляриметр (рис. 3) состоит из трубки, в которой находятся все оптические детали, и опорной стойки. В трубке находится углубление, куда вставляется кювета. Кювета поляриметра имеет длину 0,95 дм. Световой поток, отразившись от зеркала 1, проходит через оранжевый светофильтр 2, поляризатор 3, кварцевую пластинку 4, которая разделяет его на две части, и кювету 5. При вращении анализатора 6 половина поля зрения (рис. 4) освещается, а другая затемняется. Поле зрения рассматривают через окуляр 7 и через лупу шкалу 8. Оранжевый светофильтр пропускает монохроматический свет с длинной волны 589 нм.

Измерительное устройство анализатора имеет основную шкалу (верхнюю) и нониус (нижняя шкала) для определения угла поворота плоскости поляризации правовращающих («положительных») и левовращающих («отрицательных») веществ (рис. 5). По верхней (основной) шкале находят число целых градусов, по нониусу десятые доли. Угловое положение анализатора относительно поляризатора  определяется с точностью до 0,1°. Данная величина принимается за систематическую приборную погрешность (_пр = 0,1°).

Процесс измерения состоит из трех этапов. Вначале, вращая анализатор, нужно получить такое положение, при котором всё поле зрения затемняется равномерно (одноцветно), и линия раздела полей исчезает (рис. 4 б). На втором этапе находят количество полных градусов. Для этого смотрят на сколько нулевой штрих нониуса (рис. 5 а) сдвинут относительно основной шкалы вправо или влево, т.е. после какого штриха основной шкалы стоит нулевое деление нониуса. На последнем этапе замечают, какой по счёту штрих нониуса совпадает со штрихом основной шкалы (два штриха должны составлять единую линию). Для левовращающих веществ используется шкала нониуса, находящаяся слева от нуля нижней шкалы, для правовращающих – справа. Совпадающий штрих нониуса показывает десятые доли градуса, которые нужно прибавить к ранее найденному числу целых градусов. Если точно совпадают нулевое значение или последний штрих нониуса, то число десятых градусов равно нулю. Например, нулевой штрих нониуса лежит между 2° и 3° правой шкалы, и восьмой штрих нониуса совпадает со штрихом основной шкалы. Следовательно, угол поворота равен +2,8°.

а б

Рис. 5

а) угол поворота плоскости поляризации равен 2,8°; б) угол поворота плоскости поляризации равен +4,2°

Отсчёт по шкале анализатора без кюветы с раствором должен приводить к совпадению нулевых делений нониуса и шкалы (положение нуля). Однако со временем положение нуля может отличаться от истинного значения – появляется систематическая ошибка (сдвиг нуля _0,пр). Поэтому, при расчётах требуется вносить поправки на сдвиг нуля. Предположим, что нулевая точка получилась в положении анализатора _0,пр = +0,2° (знак «+» означает справа) и, если при последующем измерении c наполненной кюветой получили одинаковую освещенность в положении анализатора +2,1°, то искомый угол вращения равен + 2,1°- 0,2°= +1,9°; если же нулевая точка будет -0,2° (влево), то искомый угол поворота равен +2,1°- (-0,2°) = 2,1°+ 0.2°= 2,3° и т.д.

Концентрация неизвестного раствора (С), исходя из (1), определяются по формуле:

C = . (3)

Для её расчета необходимо знать величину удельного вращения, которую требуется предварительно рассчитать, измеряя угол поворота плоскости поляризации в растворе с известной концентрацией.

, (4)

Однако любое прямое или косвенное измерение неизбежно содержит ошибку измерения, влияющие на итоговую величину. Для учета случайных погрешностей можно использовать следующую процедуру.

График зависимости концентрации от угла поворота С = f() представляет собой прямую, проходящей через начало координат, т.е. С = k, где

. (5)

Величину k можно вычислить методом наименьших квадратов по экспериментальной зависимости С = f(), зная угол поворота  для вещества с известной концентрацией. Для этого возьмем два вещества с концентрациями С₁ и С₂. Измерим n раз углы поворота ₁ при С₁ и ₂ при С₂. Вычислим средние значения и согласно (6)

, (6)

т.к. график функции проходит через точку (0;0), то таблица будет выглядеть следующим образом

Таблица 1.

С	0	С1	С2
	0

По стандартным соотношениям теории погрешностей методом наименьшим квадратов вычислим значение k.

. (7)

Учитывая, что линия регрессии проходит через начало координат, выражение (7) упрощается до

. (8)

Удельное вращение находится по выражению (9).

. (9)

Теперь, зная k, легко вычислить концентрацию неизвестного вещества (10), достаточно определить угол поворота плоскости поляризации неизвестного раствора .

(10)