Рефрактометрические методы

Рефрактометрические методы определения общего белка сыворотки основаны на способности растворов белка к преломлению светового потока. При температуре 17,5 °С показатель преломления воды равен 1,3332, при той же температуре показатель преломления сыворотки колеблется в пределах 1,3480–1,3505. В связи с тем, что концентрация электролитов и небелковых органических соединений, влияющих на ее преломляющую способность, невелика и достаточно постоянна в сыворотке здорового человека, величина показателя преломления сыворотки крови зависит в первую очередь от содержания в ней белков. Калибровку прибора проводят сывороткой с известной концентрацией белка. Простота делает рефрактометрию удобным методом для определения содержания общего белка в сыворотке крови, хотя при ряде заболеваний, в частности, при сахарном диабете, хронической почечной недостаточности его использование может приводить к существенной ошибке.

Вопрос № 35

Осаждение белков — процесс снятия гидратной оболочки и заряда.

Два вида реакций осаждения:

1)высаливание белков — обратимый процесс; снимается только гидратная оболочка, белок сохраняет структуру и нативные свойства;

белковые частицы образуют крупные агрегаты и впадают в осадок под действием силы тяжести (седиментируют).

-высаливание белков сульфатом аммония

-высаливание белков хлористым натрием

2)необратимый процесс

поверхность нативной белковой молекулы всегда мозаична, имеет место чередование гидрофильных и гидрофобных групп аминокислотных остатков. При необратимом осаждении белков нарушается нативная конформация, теряется мозаичность, а значит способность выполнять функции. Этот процесс называется денатурацией

-осаждение белков солями тяжелых металлов (CuSO4 и Pb(CH3COO)2 )

-осаждение белков концентрированными минеральными кислотами ( HNO3 конц. иH2SO4 конц.

- осаждение белков органическими кислотами ( CCl3COOHи сульфоцилсалициловая кислоты)

Вопрос № 36

Высаливание – это обратимое осаждение белков из растворов с помощью высоких концентраций нейтральных солей: сульфата аммония, сульфата магния, хлорида натрия. Механизм высаливания заключается в дегидратации белковой молекулы и снятии заряда. На процесс высаливания влияют: степень гидрофильности белка, его заряд, молекулярная масса. Поэтому для высаливания разных белков требуется различная концентрация одних и тех же солей, разные условия рН среды. Высаливающее действие ионов зависит от из дегидратирующей способности, которая характеризуется положением в лиотропном ряду Гофмейстера:

   F-> Cl-> Br-> NO3-> I-> CNS- 

       Li+> Na+> К+> Rb+> Cs+> Mg2+> Ca2+> Sr2+> Ba2+ 

Высаливание широко используется как метод разделения белков, выделения индивидуальных белков, получения белков в чистом виде

Разделением белков плазмы крови на фракции по методу Кона часто пользуются для получения отдельных фракций крови, используемых в качестве кровозаменителей

37.

Необратимое осаждение белков.

Необратимое осаждение белков связано с глубокими нарушениями структуры белков (вторичной и третичной) и потерей ими нативных свойств. Такие изменения белков можно вызвать кипячением, действием концентрированных растворов минеральных и органических кислот, солями тяжелых металлов.

1.Осаждение при кипячении.

Белки являются термолабильными соединениями и при нагревании свыше 50-60 градусов С денатурируются. Сущность тепловой денатурации заключается в разрушении гидратной оболочки, разрыве стабилизирующих белковую глобулу связей и развертывании белковой молекулы. Наиболее полное и быстрое осаждение происходит в изоэлектрической точке (когда заряд молекулы равен нулю), поскольку частицы белка при этом наименее устойчивы. Белки, обладающие кислыми свойствами, осаждаются в слабокислой среде, а белки с основными свойствами - в слабощелочной. В сильнокислых или сильнощелочных растворах денатурированный при нагревании белок в осадок не выпадает, т.к. его частицы перезаряжаются и несут в первом случае положительный, а во втором - отрицательный заряд, что повышает их устойчивость в растворе.

Реактивы:

1) яичный белок, 1% раствор;

2) уксусная кислота, 1% и 10% растворы;

3) NaOH, 10% раствор.

Ход определения.В 4 пронумерованные пробирки приливают по 10 капель раствора яичного белка. Затем 1-ю пробирку нагревают до кипячения, при этом раствор мутнеет, но т.к. частицы денатурированного белка несут заряд, они в осадок не выпадают. Это связано с тем, что яичный белок имеет кислые свойства (его изоэлектрическая точка 4,8) и в нейтральной среде заряжен отрицательно; во вторую пробирку добавляют 1 каплю 1% раствора уксусной кислоты и нагревают до кипячения. Белок выпадает в осадок, т.к. его раствор приближается к изоэлектрической точке и белок теряет заряд (один из факторов устойчивости белка в растворе); в 3-ю пробирку добавляют 1 каплю 10% раствора уксусной кислоты и нагревают до кипения. Осадка не образуется, т.к. в сильнокислой среде частицы белка приобретают положительный заряд (сохраняется один из факторов устойчивости белка в растворе); в 4-ю пробирку наливают 1 каплю раствораNaOH, нагревают до кипения. Осадок не образуется, поскольку в щелочной среде отрицательный заряд белка увеличивается.