Микрочипы

Экспрессия генов — это процесс, в ходе которого наследственная информация от гена (последовательности нуклеотидов ДНК) преобразуется в функциональный продукт — РНК или белок. Регуляция экспрессии генов позволяет клеткам контролировать собственную структуру и функцию и является основой дифференцировки клеток, морфогенеза и адаптации.

ДНК–чипы представляют собой уникальный аналитический инструмент, позволяющий определять наличие в анализируемом образце (как правило, биологического происхождения) заданных последовательностей ДНК (т.н. гибридизационный анализ). Проведение анализа с помощью ДНК–чипов обходится в несколько раз дешевле, чем при использовании альтернативных технологий (электрофорез, ПЦР в реальном времени) и допускает, при наличии детектора несложной конструкции, работу вне лаборатории.

Впервые ДНК–чипы были использованы в исследованиях в конце 80-х годов прошлого века. В основе этого теперь уже широко распространенного метода, позволяющего одновременно анализировать экспрессию множества генов, лежит принцип узнавания мРНК-овых или кДНК-овых мишеней посредством их гибридизации с иммобилизованными на микрочипе одноцепочечными фрагментами ДНК. Современный ДНК-микрочип состоит из тысяч дезоксиолигонуклеотидов (зондов, или проб), сгруппированных в виде микроскопических точек и закреплённых на твёрдой подложке. Каждая точка содержит несколько пикомолей ДНК с определённой нуклеотидной последовательностью. Олигонуклеотиды ДНК-микрочипа могут быть короткими участками генов или других функциональных элементов ДНК и используются для гибридизации с кДНК или мРНК (кРНК). Гибридизация зонда и мишени регистрируется и количественно характеризуется при помощи флюоресценции или хемилюминесценции, что позволяет определять относительное количество нуклеиновой кислоты с заданной последовательностью в образце.

В обычном ДНК-микрочипе зонды ковалентно прикрепляются к твёрдой поверхности — стеклянному или кремниевому чипу. Другие платформы, например, выпускаемые Illumina, используют микроскопические шарики вместо больших твёрдых поверхностей.

ДНК-микрочипы используют для анализа изменения экспрессии генов, выявления однонуклеотидных полиморфизмов, генотипирования или повторного секвенирования мутантных геномов. Микрочипы отличаются по конструкции, особенностям работы, точности, эффективности и стоимости.

ДНК-микрочипы:

- кДНК-микрочипы

(двукрасочные с флуоресц. детекцией)

• oлигонуклеотидные

(двукрасочные с флуоресц. детекцией)

• олигонуклеотидные

(Affymetrix, однокрас. с флуоресц. детекцией)

• мембранные к-ДНК-микрочипы

(с радиоакт. детекцией)

- гелевые к-ДНК-чипы

(ИМБ РАН)

Белковые микрочипы

Немного истории

• 1980-е: белковые чипы

• ~1991: химия синтеза ДНК на подложке (высокой плотности) – олигонуклеотидные чипы Affymetrix (Fodor, Stryer, Lockhart)

• ~1995: роботы для микрораскапывания – кДНК чипы Stanford University (Pat Brown and Dari Shalon)

• 1990-е: гелевые чипы ИМБ

• Однако, еще в 1982 Augenlicht и Kobrin предложили DNA array (Cancer Research), а в 1984 они сделали чип, включающий 4000 элементов для исследования раковых клеток.

• (Статья была отклонена Science и Nature)

Что можно изучать с использованием ДНК-микрочипов?

- экспрессию генов в различных тканях

- экспрессию генов в норме и при патологии (в нормальных и раковых клетках)

- изменение экспрессии генов с течением времени как результат внешнего воздействия (взаимодействие клетки с патогеном, лекарством)

Профили экспрессии (паттерны) различаются у нормальных и раковых клеток или при различных типах рака. Излечимые и неизлечимые виды лейкозов дают разные паттерны. По виду паттернов можно с большой вероятностью предсказать течение болезни на самой ранней стадии.

Экспрессионные микрочипы

Одно из активно разрабатываемых направлений с применением технологии микрочипов – это исследование транскрипционных профилей при сложных заболеваниях. Хотя все клетки нашего организма обладают одной и той же переданной по наследству геномной ДНК, каждая клетка экспрессирует различные гены в виде мРНК в соответствии с типом клетки, биологическими процессами, нормальным или патологическим состоянием и т.д. Это разнообразие в профилях генной экспрессии является предметом интенсивного изучения ввиду его биологического и клинического значения. Способность технологии микрочипов анализировать экспрессию сотен и тысяч генов оказалась наиболее востребована при расшифровке такого сложного заболевания, как рак. Технология микрочипов позволяет одновременно отслеживать экспрессию десятков тысяч генов, создавая молекулярный портрет клетки. К наиболее значительным последствиям изучения профилей генной экспрессии можно отнести диагноз, стратификацию и определение прогноза при многих видах рака. Хотя гистопатологическая оценка, дополненная цитогенетическим исследованием и анализом нескольких молекулярных маркеров, все еще является золотым стандартом в постановке диагноза и определении прогноза, работы последних лет показывают, что во многих случаях она может быть заменена определением профиля экспрессии генов. Диагноз и прогноз при раковых заболеваниях требуют совместной экспертизы нескольких специалистов-практиков, таких как онкологи, патологи и цитогенетики, кроме того, окончательные выводы могут варьировать в зависимости от методических подходов и квалификации экспертов. Микрочипы могли бы полностью заменить усилия многих специалистов, кроме того, повысить точность в постановке диагноза и определении прогноза,  а  также обеспечить единую стандартизированную платформу для анализа.

Для анализа экспрессии генов используют микрочипы двух типов: на основе комплементарной ДНК (кДНК) и на основе олигонуклеотидных зондов. Микрочипы на основе кДНК представляют собой фрагменты ДНК, закрепленные на поверхности стандартных микроскопических стекол или на другой твердой подложке. В олигонуклеотидных микрочипах на такой же подложке иммобилизованы олигонуклеотиды длиной 25–60 нуклеотидных оснований (н.о.). Процедура подготовки образца при проведении анализа на микрочипах представлена на рис. 2. Из клеток выделяют тотальную РНК (иногда выделяют также фракцию мРНК), далее проводят реакцию обратной транскрипции, используя комбинированный праймер, содержащий последовательность, комплементарную полиА-концевому фрагменту мРНК, и участок промотора Т7 РНК-полимеразы. Включение в состав синтезирующейся цепи кДНК последовательности промотора Т7 РНК-полимеразы позволяет в дальнейшем провести реакцию амплификации in vitro: фермент Т7 РНК-полимераза нарабатывает в пробирке множество копий РНК с каждой молекулы кДНК. Так происходит линейная амплификация исходной мРНК. Как правило, одновременно проводят мечение образующихся молекул РНК за счет использования в реакции нуклеотидов, содержащих флюоресцентную метку. В экспериментах с олигонуклеотидными микрочипами часто используют для мечения образца комплементарной РНК (кРНК) флюоресцентную метку одного типа,  а  уровни экспрессии генов определяют, сравнивая получаемые флюоресцентные сигналы с сигналами внутренних контрольных точек микрочипа. При работе с микрочипами на основе кДНК, как правило, в эксперименте используют 2 образца: контрольный образец метят одним флюоресцентным красителем, исследуемый образец – другим, далее их смешивают и гибридизуют с одним микрочипом. По соотношению двух разных флюоресцентных меток в каждой ячейке микрочипа судят о повышении или понижении уровня экспрессии данного гена. Независимо от технологической платформы в каждом эксперименте формируются данные, содержащие оценку уровня экспрессии десятков и сотен тысяч генов. Для обработки такого количества данных используется довольно сложный математический аппарат, в первую очередь, кластерный анализ. Анализ данных, полученных с помощью микрочипов, может производиться в сопоставлении с клиническими данными (анализ, ориентированный на проверку гипотезы, supervised analysis) или безотносительно к любой клинической характеристике пациента (независимый анализ, unsupervised analysis).

Классические методы позволяют проводить анализ экспрессии нескольких  генов одновременно, либо требуют применения специализированных микрочиповых технологий, например, таких как Affymetrix. Affymetrix использует комбинацию фотолитографии и химического синтеза олигонуклеотидов для производства GeneChip® микрочипов.

YELLOW - если ген экспрессируется и в больной (Cy5) и в нормальной (Cy3) тканях, то в данном пятне будет гибридизоваться ДНК, меченная и красной и зеленой красками, и в результате получится желтый цвет

RED - если ген экспрессируется только в больной (Cy5) ткани, то в данном пятне будет гибридизоваться только ДНК, меченная красной краской

  GREEN - если ген экспрессируется только в здоровой (Cy3) ткани, то в данном пятне будет гибридизоваться только ДНК, меченная зеленой краской

  BLACK – если ген не экспрессируется ни в больной, ни в здоровой ткани

Таким образом,

• ДНК-микрочипы позволяют одновременно анализировать информацию об экспрессии многих тысяч генов.

• Основными типами использующихся в настоящее время ДНК-микрочипов являются кДНК-микрочипы и олигонуклеотидные чипы фирмы Affymetrix.

• кДНК-микрочипы основаны на гибридизации смешанных экспериментального и контрольного образцов, меченых различными флуоресцентными красками, к чипу, на поверхность которого нанесены двунитевые к-ДНК, соответствующие ~10000-20000 генам.

• Микрочипы Affimetrix основаны на гибридизации меченой биотином кРНК экспериментального образца с набором Perfect Match и Mismatch олигонуклеотидов, синтезированных на подложке чипа, с последующей прокраской стрептавидином-фикоэритрином. GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 позволяет одновременно анализировать 47000 транскриптов, среди которых 38500 охарактеризованных генов. Микрочип включает 1.300.000 олигонуклеотидов различных типов.

• Анализ полученных данных требует многоэтапной математической обработки с использованием специальных статистических методов.

В практическом отношении применение микрочипов уже сегодня позволяет решать следующие задачи:

• точная постановка диагноза, выявление новых подтипов заболевания, уточнение классификации;

• прогнозирование течения болезни и клинического исхода, выявление генов и сигнальных путей, вовлеченных в патогенез онкогематологических заболеваний, поиск новых мишеней для направленной дифференцированной терапии; 

• разработка и создание более простых и дешевых диагностических тестов, в том числе и на основе технологии микрочипов (микрочипы, содержащие пробы на десятки или сотни генов вместо десятков и сотен тысяч); 

включение микрочипов в проспективные клинические исследования, подтверждение результатов анализа на микрочипах для внесения в клинические протоколы лечения, дизайн клинических протоколов с учетом новых данных о природе заболеваний, полученных с помощью технологии микрочипов.