2. При промышленном получении рекомбинантных белков выбор микроорганизма-продуцента зависит от многих факторов.

• Определите критерии отбора микроорганизма.

Ответ

Успехи генетической инженерии привели к тому, что свыше 100 белков человека (биорегуляторов, корректоров гомеостаза, факторов врожденного и приобретенного иммунитета) могут быть получены биотехнологическим способом.

При этом технология рекомбинантной ДНК позволяет модифицировать белки человека, повышать физиологическую активность, снижать вероятность побочных реакций после введения и т.д. Это является основой создания новых лекарственных препаратов.

Критериями отбора микроорганизма при промышленном получении рекомбинантных белков являются:

микроорганизмы должны быть непатогенные

микроорганизмы должны расти в производственных условиях на экономически дешевых средах

должен быть изучен геном микроорганизма;

должен быть исследован метаболизм микроорганизма на уровне вида.

Избранные в качестве предполагаемых продуцентов микроорганизмы оцениваются и изучаются уже на уровне конкретных штаммов. При необходимости штаммы-биообъекты (как носители чужеродного генетического материала и продуценты чужеродного белка) могут быть усовершенствованы методами генетической инженерии, что позволяет свести к минимуму вероятность протеолиза чужеродных белков, гидролиза чужеродной информационной РНК и «исключения» чужеродных генов из генома.

Иногда чужеродный белок может откладываться в клетке продуцента в виде белковых гранул (в недоступной для протеаз форме), что характерно, например, для Е. coli.

Особое внимание привлекает проблема секреции чужеродных белков, так как выделение целевого белка в высокоочищенном виде из культуральной жидкости - задача гораздо более легкая, чем выделение его из клетки. Как известно, секретируемые белки отличаются от несекретируемых тем, что имеют на N-конце так называемую лидерную последовательность аминокислотных остатков, которая способствует переносу их через мембрану клетки в среду. Иногда конструируются гибридные опероны с общим промотором, включающие ген чужеродного белка и ген секретируемого белка, лидерная последовательность которого извлекает из клетки чужеродный белок. Можно использовать гибридные белки для облегчения очистки (например, использование аффинного сорбента для -галактозидазы). Далее два белка разделяются принятыми химическими или ферментативными методами.

Нельзя не отметить, что продуценты чужеродного белка не отличаются высокой способностью к выживанию в природных условиях.

В качестве продуцентов рекомбинантных белков человека в настоящее время используются: Escherichia coli (кишечная палочка), Bacillus subtilis (сенная палочка), Saccharomyces cerevisiae (пекарские дрожжи). Эти организмы достаточно безопасны, однако попадание их (как продуцентов того или иного человеческого белка) в окружающую среду по ряду причин нежелательно. В связи с этим существуют принятые и тщательно соблюдаемые правила работы с рекомбинантами. Безопасность должна соблюдаться на генетическом и на физическом уровнях.

Меры безопасности на физическом уровне заключаются в установке микробиологических фильтров в местах выброса газа, стерилизации оборудования после завершения рабочего цикла. Проблема генетического риска заключается в возможном появлении мутантов с содержанием токсичных или аллергенных для человека белков или других опасных соединений. В общем, в биотехнологическом производстве необходимо соблюдение требований «Правил организации производства и контроля качества лекарственных средств» (GMP).

3. Обоснуйте требования к глазным лекарственным формам и условиям их промышленного производства. Укажите критерии выбора вспомогательных веществ, входящих в состав глазных капель, объясните их назначение, приведите примеры.

Обоснуйте последовательность и содержание технологических стадий получения глазных капель.

Как обеспечивается одно из основных требований - стерильность (методы стерилизации и принцип работы стерилизующего оборудования)? Как контролируется этот показатель в соответствии с требованиями ГФ XI и другими нормативными документами ОЭР (принципы анализа)?

Ответ

Глазная лекарственная форма — это особая группа препаратов, предназначенная для нанесения лекарственных веществ на слизистую оболочку глаза, которая является самой чувствительной из всех слизистых организма. Они классифицируются на:

• Жидкие (глазные капли). Могут быть водными и масляными растворами, редко суспензиями или эмульсиями (примочки): растворы для орошения, растворы для очистки, дезинсекции, хранения мягких контактных линз.

• Мягкие: глазные мази, глазные лекарственные пленки, пластыри или трансдермальные терапевтические системы (ТДТС).

• Твердые: таблетки тритурационные, карандаши или офтальмологические стержни на основе полимеров.

- Газообразные: аэрозоли.

Самой распространенной ГЛФ является глазные капли — это лекарственная форма, предназначенная для инстилляции в глаз. Требования (ГФ11):

• стерильность;

• стабильность;

• чистота, прозрачность (отсутствие механических включений);

• комфортность (изотоничность и изогидричность);

• пролонгированность действия.

СТЕРИЛЬНОСТЬ — отсутствие микроорганизмов и их спор на всех стадиях их развития. Обеспечивается: приготовлением глазных капель в асептических условиях с последующей их стерилизацией методами:

- Термическими: паровой, под давлением в режиме 120° — 8 минут; текучим паром в режиме 100°-30 минут.

- Стерильная фильтрация для термолабильных веществ.

Возможности стерилизации: все лекарственные вещества можно разделить на 3 группы:

Термостабильные — растворы, которых можно простерилизовать без стабилизаторов (стойкие при высокой температуре):

Кислота борная, калия йодид, пилокарпина гидрохлорид — паровым методом 120° — 8 минут. Левомицетин 0.2%, атропина сульфат 1%, кислота аскорбиновая 0.2%, новокаин 1%, этилморфина гидрохлорид 2% - текучепаровым методом (100° — 30 мин).

Термостабильные со стабилизаторами: клофелин, сульфацил натрий.

Термолабильные вещества, раствор которых нельзя подвергать термической стерилизации, можно использовать стерильную фильтрацию через фильтры бактерицидные: резорцин, колларгол, цитраль.

Даже строгое соблюдение асептики не решает проблему полной асептики и стерильности. В процессе изготовления и применения уже на первых этапах капли обсеменяются микроорганизмами, поэтому необходимо вводить консерванты — вещества для сохранения стерильности (они задерживают и угнетают рост и развитие микроорганизмов). Исследования показали, что без консервантов ГЛС хранятся 24-48 часов, а с консервантами до 30 дней, глазные примочки без консервантов должны быть использованы свежеприготовленными, а с консервантами — до 10 дней.

Консерванты (антисептики) для глазных капель наиболее эффективны:

- Хлорбутанолгидрат (хлорэтон) — 0.05%

- Цетил пиритинилхл ори д — 0.01%

- Левомицетин — 0.2% + кислота борная — 2%

- Хлоргексидина биглюконат — 0.01 %

- Смесь сложных эфиров парааминобензойной кислоты (нипагин + нипазол = 3:1) в количестве 0.15%.

Выбор консерванта зависит от РН среды, чистоты применения глазных капель, типа упаковки и др. (глазные капли консерванты надо вводить лишь по прописи, согласно НД, или по указанию врача).

СТАБИЛЬНОСТЬ - сохранение физико-химических свойств в растворе.

В процессе приготовления, стерилизации, хранения возможно разрушение лекарственных веществ вследствие окисления, гидролиза и др. взаимодействий. Поэтому в состав глазных капель вводят стабилизаторы. По стабильности все вещества, используемые в глазных каплях можно разделить на группы:

1. Соли, образованные сильной кислотой и слабым основанием, устойчивые к гидролизу в кислой среде (дикаин, мезатон), стабилизируют кислотой борной 1,9 - 2% (рН = 5,0) (но не хлористоводородной кислотой, которая раздражает слизистую оболочку глаза) или борно-ацетатным буферным раствором (рН = 5,5). Например, глазные капли — раствор новокаина 0,5 % готовят на 2% растворе кислоты борной.

2. Соли, образованные слабой кислотой и сильным основанием, стабилизируются добавлением щелочных компонентов: натрия гидрокарбонат, натрия тетраборат или буферными растворителями с щелочными рН.

3. Легкоокисляющиеся вещества - стабилизируются антиоксидантами: натрия сульфит, натрия метабисульфит, натрия тиосульфат, трилон Б и др.

ЧИСТОТА обеспечивается фильтрованием. Глазные капли должны быть совершенно прозрачными, не содержать частиц, способных травмировать слизистую оболочку глаза. Фильтры используются стеклянные №3, №4, бумажные, тканевые, мембранные. Фильтрацию можно проводить при атмосферном давлении в аптеке и под давлением в заводских условиях.

Контроль на отсутствие механических включений проводится дважды: в аптека до и после стерилизации, на производстве - первичный контроль до стерилизации (контролером цеха) и вторичный после стерилизации (контролером отдела качества).

КОМФОРТНОСТЬ - это изотоничность и изогидричность. В случае несоответствия - неприятное ощущение, неудобство.

Все глазные капли должны быть изотоничны плазме крови, т.е. должны иметь такое же осмотическое давление. Изотонический раствор NaCl = 0,9%(+ 0,2%), т.е. 0,7 - 1,1%, все растворы должны соответствовать этому раствору NaCl по осмотическому давлению, т.е. должны быть эквивалентны по давлению.

Изотонический эквивалент - это количество NaCl, создающее такое же осмотическое давление, что и 1,0 лекарственного вещества.

Если вещества несовместимы с NaCl, могут использоваться Na2S04, NaN03, AgN03.

Изогидричность - это одинаковость рН раствора - слезной жидкости. В слезной жидкости рН=7,4, относительно комфортными будут кали с рН = 4,5 - 9,0.

Удобно использовать буферные растворители:

- боратный буфер (кислота борная 1,9% + натрия тетраборат 2,68%)

- борно-ацетатный (кислота борная 1,9% + натрия ацетат 1,5%)

Они повышают стабильность глазных капель, уменьшают дискомфорт. Их используют в стандартных прописях глазных капель.

Пролонгированность действия - максимально продолжительное действие ЛВ. Добавляют пролонгаторы - биорастворимые полимерные материалы: ПВС 1,5 %, по указания врача или по составу прописи.

Особенности технологии глазных капель:

1) Если в составе прописи выписана глюкоза, то надо рассчитывать с учетом влажности.

2. Если в каплях выписана глюкоза с аскорбиновой кислотой, то готовить надо без стабилизатора на свежепрокипяченной воде очищенной, стерилизация при 100° - 30 мин.

3. Если глазные капли нестандартные, то готовить надо на стерильной очищенной воде в асептических условиях без стерилизации.

В промышленных условиях готовят глазные капли в виде водных растворов на воде для инъекций или на стерильных жирных маслах (персиковом, миндальном, вазелиновом), а также в виде тонких суспензий и эмульсий, соблюдая следующие условия:

• применение антиоксидантов и газовую защиту для легкоокисляющихся веществ (натрия

сульфацил, кислота аскорбиновая)

• введение консервантов (например, бензалконий хлорид в состав глазных капель «Аллергодил»

0,05% раствор — производство Германия)

• введение пролонгаторов (МЦ — для раствора пилокарпина гидрохлорида, ПВС для геля глазного

«Офтагель» - производство Финляндии)

- совершенствование упаковки (тюбик-капельница, флакон-капельница).