6. При получении штаммов суперпродуцентов аминокислот, например, треонина или лизина, используют только определенные микроорганизмы.

• Подберите соответствующий микроорганизм для получения штамма суперпродуцента лизина и выберите путь его биосинтеза.

Ответ

Аминокислоты - мономеры белков – органические соединения, содержащие аминогруппу, карбоксильную группу и боковую цепь, специфичную для каждой аминокислоты. Природные аминокислоты - -аминокислоты, соединения, в которых аминогруппа связана с тем же атомом углерода, что и карбоксильная группа:

В образовании белков участвуют 20 природных -аминокислот, они кодируются генетическим кодом. Девять аминокислот – незаменимые, не могут синтезироваться в организме человека и обязательно должны присутствовать в рационе питания.

Аминокислоты – оптически активные соединения. Физиологически и терапевтически активны – L-формы аминокислот. Современные методы органического синтеза позволяют синтезировать эквимолярную смесь L- и D-аминокислот (рацематы), дальнейшее разделение которых представляет трудную задачу и экономически не эффективно.

Микробиологический синтез аминокислот с использованием микроорганизмов-продуцентов позволяет получить исключительно терапевтически важные L-формы аминокислот. В качестве биообъектов применяются штаммы-продуценты аминокислот – микроорганизмы рода Corynebacterium (почвенный микроорганизм), E. Coli (кишечная палочка — симбионт человека), Васillus subtilis (сенная палочка - почвенный микроорганизм).

Использование этих микроорганизмов для получения аминокислот основано на их способности самостоятельно синтезировать все 20 аминокислот. Аминокислоты – первичные метаболиты.

Индукция и репрессия в биотехнологии

Образование многих первичных метаболитов (в том числе аминокислот) регулируется на нескольких уровнях.

1) конечные продукты метаболических путей (аминокислоты) ингибируют активность ферментов первых стадий биосинтеза (на уровне связывания с ферментами). Этот процесс называется ретроингибированием.

2) конечные продукты метаболических путей тормозят биосинтез ферментов последних его этапов (на уровне функционирования ДНК). Так низкомолекуляный метаболит может связаться с белком-репрессором, переводя его в активное состояние. Активный репрессор взаимодействует с определенным участком ДНК, блокируя связывание РНК-полимеразы. Этот феномен был назван репрессией.

Масштабировать производство аминокислот можно следующим образом

1) использовать мутантные штаммы-суперпродуценты

2) использовать оптимальную питательную среду для обеспечения высоких выходов аминокислот (концентрации источников углерода, аммонийного азота, минеральных солей, ростовых факторов, рН и температура).

Производство L-лизина

L-лизин - незаменимая белковая аминокислота, структурная формула лизина:

Типичные продуценты лизина – Brevibacterium flavum и Corynebacterium glutamicum.

Эффекта накопления в среде всего одной целевой аминокислоты (L-лизина) добиваются путем блокирования процессов, ведущих к синтезу побочных аминокислот, возникающих в связи с разветвлением метаболического пути.

Образование лизина в клетке бактерии осуществляется под строгим метаболическим контролем. Аспартаткиназа фермент, который открывает метаболический путь. Аспартаткиназа ингибируется по принципу обратной связи при совместном и согласованном действии побочных продуктов L-треонина и L- лизина.

При накоплении треонина и лизина в избыточной концентрации ингибируется аспартаткиназа и их синтез останавливается, при пониженной концентрации любой из двух аминокислот процесс активизируется. Таким образом, вызвать сверхсинтез лизина можно лишь нарушив синтез треонина или его предшественника – гомосерина. Большинство продуцентов лизина не способны синтезировать гомосерин или треонин, то есть являются «ауксотрофами» по этим аминокислотам.

Перспективным для получения лизина считается использование мутантов 2-х типов.

1) мутанты, у которых нет гомосериндегидрогеназы, в результате чего блокируется синтез метионина и треонина. У них существенно снижена внутриклеточная концентрация треонина, что снимает блокаду с аспартаткиназы. В среде, где присутствуют лимитирующие концентрации метионина и треонина, образуются избыточные количества лизина

2) Мутанты, дефектные по гену, определяющему конформацию аспартаткиназы. Такой мутантный фермент теряет чувствительность к высоким концентрациям аллостерического ингибитора — лизина.

Технология производства лизина

Питательная среда для культивирования Corynebacterium glutamicum, продуцента лизина, должна содержать источники углерода (глюкоза, сахароза). Для снижения стоимости питательной среды используют вторичное сырье – отходы пищевой промышленности – свекловичная меласса, гидролизаты крахмала, сульфитные щелока. Источники азота – мочевина и соли аммония. Для роста и развития микроорганизмы нуждаются в стимуляторах роста – ферментах и витаминах, для этого в среду вносят кукурузные и солодовые экстракты, гидролизаты дрожжей, витамины. Среда должна содержать (в л): 200 мг метионина, 800 мг треонина, 15–20 мкг биотина (при меньших концентрациях биотина синтезируется глутаминовая кислота, при 2,5 мг – молочная кислота, как механизм обратного действия). Соотношение углерода и азота в среде оптимально как 11:1 (при его увеличении выход лизина падает, при уменьшении – накапливается аланин). В среду вносят мел для нейтрализации органических кислот, а также кашалотовый жир или синтетические масла как пеногасители.

Культивирование осуществляется в строго стерильной глубинной аэробной периодической культуре. Процесс длится 48–72 ч при 29–30°С, контролируемом рН 7,0–7,5, непрерывном перемешивании и избыточном давлении 20–30 кПа. Продуценты лизина – аэробы, поэтому через специальные барботеры подается стерильный воздух. При ухудшении условий аэрации происходит образование молочной кислоты.

Лизин появляется в культуральной среде, начиная с середины экспоненциальной фазы роста клеток и достигает максимума к ее концу. Культивирование продуцентов лизина ведут в две стадии. На первой (25 – 30 ч), в питательной среде с 0,5 – 1,5 г/л гомосерином или треонином происходит активный рост биомассы продуцента без синтеза лизина. На второй стадии, как только треонин исчезает из среды и рост биомассы прекращается, начинается активный синтез лизина. По завершении ферментации (через 55 – 72 ч) жидкую фазу отделяют от клеток фильтрованием и используют ее для выделения лизина.

Выделение лизина. Высокоочищенные препараты лизина получают после фракционирования фильтрата методом ионообменной хроматографии на катионите. С этой целью фильтрат обрабатывают кислотой соляной до рН 1,6 – 2,0, при этом лизин превращается в катион и прочно сорбируется на отрицательно заряженном катионите.

Элюцию (десорбцию) очищенного лизина проводят раствором аммиака. Далее элюат концентрируют упариванием в вакууме, переводят в форму монохлоргидрата, высушивают и очищают перекристаллизацией.

Биотехнологическое производство треонина.

L-Треонин –незаменимая аминокислота. Треонин – одна из двух белковых аминокислот, имеющая два оптически активных (хиральных) центра. L-Треонин - (2S,3R)-2-амино-3-гидроксибутановая кислота.

Продуцент треонина - Escherichia coli (кишечная палочка). Регуляция биосинтеза треонина в кишечной палочке более сложная, чем в C. glutamicum. E.coli имеет три аспартаткиназы. Они по-разному ингибируются треонином, изолейцином, метионином и лизином.

На продукцию треонина оказывают влияние и ферменты, катализирующие биодеградацию треонина.

Несколько подходов были использованы для увеличения продукции треонина:

• Использование мутантов-ауксотрофов по тем аминокислотам, которые могут конкурировать за источники углерода с треонином (ауксотрофными называются мутанты с ограниченной способностью к образованию конечных продуктов).

• Использование мутантных штаммов E.coli, которые содержат дефекты в генах ферментов метаболического пути, так что эти ферменты уже не способны ингибироваться по принципу обратной связи.

Для обхода ретроингибирования продуценты аминокислот выращивают на средах, содержащих аналоги аминокислот - антиметаболиты, не включающиеся в обмен веществ. Выживают мутанты дефектные по механизму регуляции фермента по принципу обратной связи. Эти мутанты перспективны в отношении сверхсинтеза целевого продукта.

В 1969 г был получен мутант кишечной палочки, устойчивый к структурному аналогу треонина – -амино--гидроксивалериановой кислоте. Выжившие мутанты были дефектны по гену аспартаткиназы, т.е. с дефектами в механизме регуляции активности фермента по принципу обратной связи. Кроме того мутант являлся ауксотрофом по изолейцину. Такие мутанты называют ауксотрофно-регуляторными.

Методы генетической инженерии открывают новые подходы к получению мутантов-сверхпродуцентов аминокислот. Технологии рекомбинатных ДНК позволяют выделить «треониновые гены», вставить в плазмиды и «размножить» в клетках удобного микроорганизма. Это позволит резко повысить выход биотехнологического продукта.

Применение аминокислот

Аминокислоты широко применяют в медицине для терапии послеоперационных больных, при лечении заболеваний ЦНС, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, печени (серотонин, аспарагин, валин, гистидин, глицин, глутамин и глутаминовая кислота, изолейцин, лейцин, метионин, пролин, тирозин, триптофан, фенилаланин, цистеин); в пищевой промышленности в качестве усилителей вкуса и аромата, антиоксидантов и пищевых добавок (аланин, аспарагиновая кислота, глицин, глутаминовая кислота, лизин, цистеин); в сельском хозяйстве - в качестве кормовых добавок (лизин, треонин); в химической промышленности - как исходные вещества при синтезе полимеров и производстве косметических средств.