8. Заключение

Posted: Sun Dec 06, 2009 3:08 am    Post subject: МЕТОДИКА ВЫДЕЛЕНИЯ ФАГОВ БАКТЕРИЙ ВИДА BACILLUS CEREUS

УДК 619:579  МЕТОДИКА ВЫДЕЛЕНИЯ ФАГОВ БАКТЕРИЙ ВИДА BACILLUS CEREUS И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В ВЕТЕРИНАРИИ  Калдыркаев А.И., Феоктистова Н.А., Юдина М.А., Арзамаскина Н.А., Уколова Ю.В., Лаврова Ю.А.  Ассоциация практикующих ветеринарных врачей, Ульяновск  Бактериофаг - вирус способный инфицировать бактериальную клетку, репродуцировать в ней, образуя многочисленное потомство, и вызывать ее лизис, сопровождающийся выходом фаговых частиц в среду обитания бактерий [2].  Роль бактериофага как средства терапии и профилактики некоторых инфекционных заболеваний в настоящее время невелика, а значение для лабораторной диагностики ряда инфекции этот биологический объект не только не утратил, а, наоборот, начал привлекать к себе все более пристальное внимание исследователей. С каждым годом повышается значимость бактериофагов как высоко специфического диагностического средства, позволяющего надежно дифференцировать возбудителей бактериальных видов, а порой проводить более детальную дифференциацию отдельных типов и вариантов внутри данного вида. Возможность фагоидентификации вытекает из специфичности действия фагов, которая может быть настолько выражена, что позволяет дифференцировать не только отдельные виды, но и серологически неотличимые штаммы в пределах одного вида.  Поэтому все большее число исследователей предпочитают обращаться к фаговым тестам, как единственному средству, способному дифференцировать близкородственные штаммы. Фагодиагностика основана на специфической способности фагов взаимодействовать с определенными видами (идентификация) или типами (фаготипирование) бактерий, в результате чего происходит их лизис. Феномен лизиса является основой для использования фага в диагностических целях. Метод фагодиагностики широко используется в лабораторной практике для идентификации различных видов микроорганизмов.  Благодаря типовым бактериофагам можно изучить мониторинг распространения бактерий, возможность установить источник и путь передачи инфекционного заболевания, т.е. провести его эпидемиологический анализ. Так в Канаде в промежуток с 1986 по 1993 было отобрано 146 изолятов Bacillus cereus причастных к 18 вспышкам пищевого отравления. Из них 142 штамма было разделено на 17 типов фагов [5].  Так же с помощью специфичных фагов можно выявлять бактерии вида B. cereus в кормах для домашних животных, которые являются причиной пищевых отравлений. Bacillus cereus способны вызывать диарейный синдром у животных, птицы и насекомых, по истечении 6-18ч, первично обусловленный несколькими видами токсинов и, впоследствии, размножением данного микроорганизма в кишечнике. Bacillus cereus продуцирует: гемолизин BL (НBL), негемолитический энтеротоксин (NHE) и энтеротоксин Т (bc-D-ENT). Продукция этого комплекса токсинов вызывает цитотоксический эффект и секрецию жидкости в кишечнике, при постановке биопробы на мышах наблюдается некроз кожи в месте введения и гибель. Один из основных энтеротоксинов – НBL состоит из 3-х пептидов 1-го связывающего и двух литических. Детекцию этого токсина методом ИФА (Tecra visual immunoassay [VIA]; Bioenterprises Pty. Ltd., Roseville, New South Wales, Australia) используют в качестве критерия токсигенности выделенного штамма. С помощью ПЦР на ген НBL было установлено, что от 41 до 49% изолятов Bacillus cereus способны к его синтезу.  В исследованиях использовались 4 штамма B.cereus №96, №8035, №2527, №IP5832, которые были получены из музея Научно-исследовательского инновационного центра микробиологии и биотехнологии из музея кафедры МВЭ и ВСЭ ФГОУ ВПО «Ульяновская ГСХА».  Для выделения бактериофагов за основу была взята методика Адамса [1].  Исследуемый материал (сточные воды, землю, навоз), помещали в МПБ в пропорции 1:20 (10 г/мл субстрата + 200 мл МПБ), сюда же добавляли 1-2 мл. суточной индикаторной культуры (для ускорения работы и уменьшения манипуляций возможно смешивание индикаторных культур, но это не всегда полезно так как некоторые штаммы подавляли продуцирование фага на всех остальных культурах). Суспензию исследуемого материала и культуру инкубировали не более 18-24 часов при температуре (37±1)С0 (длительный срок инкубации приводит к переходу вегетативных форм бацилл в споровую). Далее суспензию фага и бактерий очищали от видимых примесей механическим фильтрованием. После чего исследуемую суспензию центрифугировали 30 мин. при 3000 об/мин. до полного ее просветления. Прогревание в течение 30 мин. при 65±5°С позволяло инактивировать сопутствующую микрофлору (экспериментально доказано, что вегетативные формы B.cereus устойчивы к этому диапазону температур).  Следующий этап – обработка хлороформом в соотношении 3:10 в течение 30-40 минут (время отстаивания 10 минут).  Обработанную суспензию фага высевали на чашки Петри методом агаровых слоев по Грациа (1936): в 3 мл. 0,7% МПА, расплавленного и остуженного до 45-50°С добавляли по 0,2 мл суточной бульонной культуры В.cereus и исследуемую суспензию фага в количестве 0,5 мл. Перемешивали и распределяли по поверхности агаровой среды в чашках Петри. Посевы инкубировали в условиях термостата в течение 6-12 часов при 37°С.  При наличии негативных колоний фага, отвивали бактериальной петлей отдельную колонию и начинали ее пассировать (повышать литическую активность). В пробирку с 4,5 мл МПБ вносили 0,2 мл фаголизата и 0,2 мл материнской культуры, инкубировали в условиях термостата в течение 6-12 часов при 37°С, определяя время пассажа по росту культуры в контрольной пробирке (в 4,5 мл МПБ вносили 0, 2 мл суточной аналогичной культуры). Типичный процесс роста бульонной культуры B.cereus – это первичное помутнение держится 18 - 20 часов, после чего формируется густая серо-белая бактериальная пленка, которая легко разбивается и всегда ложится на дно. Одновременно с образование пленки идет просветление бульона за счет распределения бактерий на дне и поверхности бульона. Сам бульон становится прозрачным без видимых помутнений.  Селекцию бактериофагов и повышение их литической активности проводили методом пассирования фага на индикаторной культуре с периодической отвивкой типичных негативных колоний по методике, описанной И.М. Габриловичем (1992), С.Н. Золотухиным (1994) [4].  Для этого, исследуемый бактериофаг засевали по методу агаровых слоев по Грациа (1936), используя разведения 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10,чтобы на питательной среде сформировались отдельные негативные колонии. После 6-12-часового культивирования в термостате одну негативную колонию, расположенную от других не менее чем в 10 мм, отвивали бактериологической петлёй на мясопептонный бульон, туда же вносили индикаторную культуру в количестве 0,2 мл. Одновременно ставился контроль: мясопептонный бульон, засеянный индикаторной культурой в количестве 0,2 мл. Пробирки культивировали в термостате при 37 0С в течение 6-12 часов. Полученный фаголизат прогревали в водяной бане при 65±5°С в течение 30 минут и исследовали методом агаровых слоев по Грациа, затем отбирали негативную колонию идентичную исходной, с которой вновь проводили такую же операцию.  В обычных пассажах без отсева негативных колоний прозрачная среда в опытной пробирке без пленки и наличия осадка, при наличии характерного роста B.cereus в контроле, свидетельствует об активной работе бактериофага, лизирующего материнскую культуру за определенный промежуток времени.  Результаты исследований и их обсуждение. На данный момент в России используемых в ветеринарной практике фагов B.cereus нет.  Целью наших исследований, а именно этого опыта, было выделение типовых фагов B.cereus. В качестве индикаторных культур использовались только референс-штаммы B.cereus №96, №8035, №2527, №IP5832.  В ходе опытов нами было выделено из 10 проб кормов и селекционировано 3 штамма бактериофагов на следующие материнские культуры: B.cereus №96 – 1; B.cereus №8035 – 1; B.cereus №2527 – 1.  В результате проведенных исследований было выделено 3 штамма бактериофагов вида B.cereus. Дальнейшая наша работа направлена выделение специфических цереусных бактериофагов и конструирование биопрепарата, использование которого позволит проводить индикацию и идентификацию бактерий вида B.cereus за 24 часа. Для работы с бактериофагами достаточно иметь одного подготовленного специалиста, комплект фаговых биопрепаратов, минимум лабораторной посуды, термостат, водяную баню, ступку с пестиком, мясопептонный бульон, мясопептонный агар. Разработанный диагностикум позволит быстро и качественно дифференцировать возбудителя заболевания и рекомендовать соответствующее лечение с учетом устойчивости возбудителя к назначаемым ветеринарными врачами антибиотикам.  Определяя фаготипы бактерий, вызывающих заболевание, можно не только распознать подлинный источник возбудителя инфекции, но и проследить сложный путь возбудителя от источника к восприимчивому организму. По образному выражению А.С. Кривиского (1962), «нередко фаг, как настоящий следопыт, помогает эпидемиологу и врачу-инфекционисту распознать возбудителя, проследить за его распространением и обезвредить источник его происхождения, предотвращая тем самым распространение эпидемии, соответственно и эпизоотии» [3].  Литература  1. Адамс М. Бактериофаги. – М., 1961. – С. 26-121.  2. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия. – М.: Медгиз,1961. – С. 6-184.  3. Кривиский А.С. Вирусы против микробов – М.,1962. – С.23-29.  4. Феоктистова Н.А. Выделение и изучение биологических свойств бактериофагов рода PROTEUS, конструирование на их основе биопрепарата и разработка параметров практического применения: Автореф. дис. … канд. биол. наук. Саратов, 2006. – 21с.  5. Ahmed.R., Sankar-mistry P., Jackson. S., Ackermann H. W., and Kasatiya S.S. Bacillus cereus Phage Typing as an Epidemiological Tool in Outbreaks of Food Poisoning // Journal of clinical microbiology, Mar. 1995, p. 636–640.