Экспериментальные методы исследования биоэлектрических явлений. Опыт Гальвани.

а). Первый опыт Гальвани (сокращение с металлом, 1786). Нервно-мышечный препарат лягушки укладывают на препаровальный столик и прикасаются к нерву гальваническим пинцетом, одна бранша которого цинковая, а другая - медная. Наблюдают возникающее при этом сокращение.

б). Второй опыт Гальвани (сокращение без металла 1794). Приготовить препарат задней лапки лягушки и тщательно отпрепарировать седалищный нерв от позвоночника до коленного сустава. Затем пересечь мышцы бедра в нижней трети и стеклянным крючком быстро набросить нерв на мышцы так, чтобы он одновременно коснулся поврежденной и неповрежденной поверхности. Мышцы голени при этом сокращаются. Опыт получается том случае, если нерв сохранил высокую возбудимость, а мышцы бедра только что пересечены.

Выработка условного мигательного рефлекса на звонок.

Испытуемый и экспериментатор садятся друг напротив друга у стола. На испытуемого надевают очковую оправу с укрепленной на нее грушей для подачи воздуха. Нажимать на грушу следует слегка, чтобы струя воздуха не вызывала болевых ощущений. Включают на несколько секунд звонок и убеждаются, что звук мигания не вызывает.

Приступают к выработке условного мигательного рефлекса на звонок:

а) включают звонок и тотчас же нажимают на грушу, подавая струю воздуха. Такое сочетание повторяют 5-6 раз, с интервалом не менее 1 мин.

б) после этого включают звонок, не присоединяя к нему подачу воздуха и наблюдают мигательный рефлекс без раздражения роговиц и склеры.

Подсчет эритроцитов камерным методом.

В пробирку точно отмеряют 4 мл 3% р-ра NaСl. Кровь для анализа забирают из пальца левой руки, предварительно обработанного спиртом. Укол нужно делать сбоку пальца, где капиллярная сеть гуще, на глубину 3 мм. Забор крови осуществляется капиллярной пипеткой Сали, промытой 3% раствором NаСl. Кровь взять до круговой отметки капилляра (0,02 мл) и осторожно продуть в пробирку с разводящей жидкостью, промывая последней пипетку. Пробирку закрыть большим пальцем и перевернуть, перемешивая таким образом содержимое пробирки. Получили разведение крови 1:200. Подсчет эритроцитов ведется в счетной камере Горяева. Перед заполнением камеры необходимо ее и покровное стекло притереть к камере так, чтобы появились радужные кольца по краям покровного стекла.

Разбавленную кровь встряхнуть несколько раз. Концом стеклянной

палочки взять из пробирки взвешенную каплю крови и опустить у края

покровного стекла со стороны счетной камеры. После заполнения

оставить камеру в покое на 1 минуту для оседания эритроцитов.

Эритроциты считать под большим увеличением в 5 больших квадратах, разделенных на 16 малых (5x16) = 80, расположенных по диагонали. Счету подлежат те эритроциты, которые находятся внутри квадрата и на верхней и на левой его границах. Результаты подсчета заносят в тетрадь на предварительно начерченную сетку. Вычисление количества форменных элементов в 1 мм кубическом производят по следующей формуле:

Х= А х 4000 х Б

С

Где х - кол-во эритроцитов в 1 мм кубическом,

А - кол-во эритроцитов в 80 малых квадратах,

Б - степень разведения (200),

С - кол-во малых квадратов (80), 1/4000 - объем малого квадрата.

Чтобы получить количество эритроцитов в 1 литре нужно полученную цифру умножить на 1 000 000 (1 мм³ = 1 мкл., в 1 л - 10 000 000 мкл).

Подсчет лейкоцитов камерным методом.

В центрифужную пробирку отмеривают пипеткой 0,4 мл 3% раствора уксусной кислоты. Затем капиллярной пипеткой Сали набирают 0,02 мл крови из пальца удаляя излишек крови касанием кончика пипетки о тугой ватный тампон. Кровь осторожно выдувают в приготовленный раствор и тщательно перемешивают. В этом случае кровь будет разведена в 20 раз. Лейкоциты считают в 100 больших не разлинованных квадратах камеры Горяева, что соответствует 100x16 = 1600 малым. Вычисление количества форменных элементов крови производят по следующей формуле:

Х = А x 4000 x 20 / 1600

Где:

X - кол-во лейкоцитов в 1 мм³,

А - кол-во лейкоцитов, сосчитанных в 100 больших квадратах. Таким образом, для получения результата достаточно практически умножить количество сосчитанных лейкоцитов на 50. В пересчете на литр крови общее число лейкоцитов составляет 5x10⁹ (5х10⁹/л).

Определение количества гемоглобина и цветового показателя

Гемометр Сали представляет собой стойку с тремя гнездами, в два крайних гнезда вставлены запаянные пробирки со стандартной цветной жидкостью, в среднее гнездо вставлена градуированная пробирка для испытуемой крови. Цифры деления шкалы выражают количество НВ и %. К гемометру прилагается капиллярная система на 0,02 мл крови, пипетка для воды, стеклянная палочка.

Градуированная пробирка заполняется до нижней кольцевой отметки 0,2 н раствором НС1. В капиллярную пипетку набирают 0,02 мл крови из пальца. Кончик пипетки опускают на дно пробирки с раствором НС1 и выдуваем кровь так, чтобы верхний слой НС1 остался неокрашенным. Не вынимая пипетки споласкивают ее соляной кислотой. Содержимое перемешать и оставить стоять на 5-6 мин, пока идет образование соляно - кислого гематина. Затем к раствору добавляют по каплям дист, воду до тех пор, пока цвет испытуемого раствора не совпадает со стандартным. Цифра, стоящая на уровне полученного раствора показывает содержание НВ в испытуемой крови.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЦВЕТОВОГО ПОКАЗАТЕЛЯ

Соотношение между количеством НВ и числом эритроцитов носит название цветового показателя. Он позволяет оценить степень насыщения эритроцитов гемоглобином. Высчитывают его по формуле:

Ц.П.= Найденное кол-во НВ х Нормальное число эритроцитов Нормальное кол-во Нв х Найденное число эритроцитов

Упрощенный метод:

Формула определения Ц.П. = Кол-во НВ г% х 3

АВС

АВС -первые три цифры числа эритроцитов (например 4,2x10¹² => 420). В норме Ц.П. колеблется от 0,85 до 1,1. Если Ц.П. выше 1,1 гиперхромия, ниже 0,8 - гипохромия.

Определение соэ

При стоянии стабилизированной крови эритроциты в силу своей тяжести оседают. При некоторых физиологических состояниях и при целом ряде заболеваний оседание эритроцитов бывает значительно ускоренным.

Для определения скорости оседания эритроцитов (СОЭ) применяется прибор Панченкова, состоящий из штатива, в котором могут быть фиксированы в вертикальном положении специальные капилляры, градуированные в мм. Метка 0 стоит на расстоянии 100 мм от конца. На этом же уровне находится метка К.

Капилляр промывают раствором цитрата натрия, затем набирают 25 мм этого раствора и выдувают в пробирку. В тот же капилляр набирают кровь до метки К и выдувают в приготовленную пробирку с цитратом натрия. Хорошо смешивают, насасывают в капилляр до метки К-О, ставят в штатив и засекают время. Полученное соотношение крови и цитрата натрия 1:4.

Через час отсчитывают по делениям на капиллярной пипетке величину отстоявшегося столбика плазмы.

В норме скорость оседания эритроцитов равна:

у женщин – 8-15 мм/ч

у мужчин – 6-12 мм/ч

у новорожденных - до 2 мм/час.

Определение групповой принадлежности крови по системе ав0. Реакция на индивидуальную совместимость, биологическая проба при переливании крови

МЕТОД СЫВОРОТОК

На планшет для определения группы крови в 4 углубления нанести по капле сыворотки I, II, III, IV групп крови. Делают прокол пальца и стеклянной палочкой в каждую каплю сыворотки вносят небольшую каплю крови, каждый раз, тщательно протирая палочку. Крови должно быть в 3-4 раза меньше, чем сыворотки.

Кровь и сыворотку размешивают до равномерного окрашивания смеси. Через 5-7 минут при наличии агглютинации капля становится прозрачной, а эритроциты склеиваются в комочки и крупинки.

В зависимости от того, с какими сыворотками агглютинирует кровь, различают группы крови:

I- агглютинация отсутствует,

II - агглютинация происходит с сыворотками из I и III групп,

III- агглютинация происходи с сыворотками из I и II групп,

IV- агглютинация происходит с сыворотками из I, II и III групп.

МЕТОД ЦОЛИКЛОНОВ

В настоящее время для определения групп крови пользуются моноклональными антителами против агглютиногенов А и В, получивших название цоликлоны. Обычно раствор цоликлонов анти-А окрашен в розовый цвет, а анти-В в голубой. Порядок определения группы крови тот же, как и при методе сывороток, только при проведении анализа растворы цоликлонов добавляются в две лунки. Результаты считывают в течение 3-х мин.

При этом если агглютинация не происходит, то группа крови I. Если агглютинация происходит с обеими цоликлонами (анти-А и анти-В), то группа крови IV. Если агглютинация выявляется с моноклональными антителами против агглютиногена А, то это II группа крови. При наличии агглютинации с цоликлоном анит-В группа крови III.

Проба на индивидуальную совместимость

Поместите в лунку планшета каплю цитрата натрия, а в нее внесите по капле крови от 2-х испытуемых. Тщательно перемешайте. При появлении хлопьев говорят об агглютинации и несовместимости образцов крови. В идеале для решения вопроса об индивидуальной совместимости смешиванию на стекле или планшете подвергается сыворотка (источник агглютининов) реципиента и эритроциты (источник агглютиногенов) донора, что отражает правило Ландштейнера.

Биологическая проба

Струйно переливается 10-15 мл крови, затем в течение 3 мин оценивается состояние пациента. В случае отсутствия явлений несовместимости (учащение пульса, дыхания, одышка, гиперемия лица) вновь вводят 10-15 мл крови и снова наблюдают за больным. Такую процедуру повторяют 3 раза. Отсутствие реакции при троекратной проверке дает право продолжать переливание.