3.Молекулярно-генетические методы для выявления генов устойчивости пшеницы к возбудителям ржавчины
В данной исследовательской работе использовались сорта мягкой пшеницы,проводилось выявление генов устойчивости к различным болезням, это бурой (Puccinia triticina Rob.ex Desm. f.sp. tritici Erikss. et Henn.) (Lr – leaf rust) Lr гены устойчивости – Lr19, желтой ржавчины (Puccinia striiformis West. f.sp. tritici Erikss. еt Henn.) (Yr – yellow rust) Yr гены устойчивости – Yr17, Yr 24, стеблевой ржавчины (Puccinia graminis Pers. f.sp. tritici Erikss. еt Henn.) (Sr - stem rust) Sr гены устойчивости – SR9a, Sr31, Sr32, Sr33. Было исследовано порядка 40 сортов, на устойчивость к разным типам ржавчины. Использовалась унифицированная схема для создания master mix и программ амплификации:
Соответственно формула расчета квоты р-ра на одну пробирку для каждого праймера была - Nмкл=25мкл-(Xмкл+Yмкл) Значения для X,Y,n и t-T брались из описания праймера.Были проведены исследования на гены Sr9a, Sr31, Sr32, Sr33, Yr24, Yr17, Lr 19.
ПЦР с праймером Sr 9a. Исследовалось 37 образцов ДНК +К +Кч
Мастер
miх
на 40 пробирок:
Объем
мастер микс на 1 образец = 23 мкл + 2 мкл
ДНК =25 мкл\
Электрофорез:
1
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
16 17 18 К М Кч
Рис. 1. Электрофореграмма Ген Sr 9a, условия эксперимента - (85 мл ТБЕ+1,2г агара), 20 слот гель, В-105, А-120, Т-110 мин, ПЦР продукта по 12 мкл, М 2,5 мкл, красителя по 5 мк. Схема – 1-18 К М Кч
Примечания - цифрами сверху указаны номера исследуемых ДНК. Маркерный расчет (по линиям снизу на верх) – 50, 10, 150, 200, 300 и .т.д. пар нуклеотидов
19 20 21 23 24 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 М
Рис. 2. Электрофореграмма Ген Sr 9a, условия эксперимента - (85 мл ТБЕ+1,2г агара), 20 слот, В-105, А-120, Т-120 мин, ПЦР продукта по 12 мкл, М 2,5 мкл, красителя по 5 мк. Схема – 18-37 М Кч
Примечания - цифрами сверху указаны номера исследуемых ДНК. Маркерный расчет (по линиям снизу на верх) – 50, 10, 150, 200, 300 и .т.д. пар нуклеотидов
Таким образом мы видим что искомый ген находится в сортах номер – 1, 3, 6, 17, 19, 20, 24, 27, 31, 32, 34, 37, поскольку линия выпадания данного гена будет находится на прямой линии проложенной между третьей и четвертой отметкой маркера в агарозном геле.
ПЦР с праймером Sr 31. Исследовалось 36 образцов ДНК +К+К+Кч
40 –для Sr 31 41 –контроль на ген
-
master mix(х20)
программа режим амплификации
1
20
40
SR 31
1200 bp
Н2О
17.87
671,2/684,9
94⁰ - 3'
Праймер F
0,64/
0,54
25,6/
21,8
94⁰ - 1'
˥
праймер R
0,8/
0,63
35,2/
25,3
55⁰ - 1'
}
X45
10x bufer
2,5
50
100
72⁰ - 2'
˩
MgCl2
1,5
30
60
72⁰ - 10'
dntp mix
0,5
10
20
hold - 4⁰
Taq pol
0,2
4
8
Объем мастер мих на 1 образец = 23 мкл + 2 мкл ДНК =25 мкл
Электрофорез:
1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 М Кс К н
Рис. 3. Электрофореграмма Ген Sr 31, условия эксперимента - (85 мл ТБЕ+1,2г агара+3мкл бр эт), (1200 bp), 20 слот, В-105, А-120, Т-1.15, ПЦР продукта по 12 мкл, М (50 п.н.) по 3,5 мкл, красителя по 5 мкл. Схема- 1-17, Кс, Кн
Примечания - цифрами сверху указаны номера исследуемых ДНК. Маркерный расчет (по линиям снизу на верх) – 50, 10, 150, 200, 300 и .т.д. пар нуклеотидов
19 20 21 23 24 25 26 27 28 29 М 30 31 32 33 34 35 37 38 41
Рис. 4. Электрофореграмма Ген Sr 31, условия эксперимента - (85 мл ТБЕ+1,2г агара+3мкл бр эт), (1200 bp), 20 слот, В-105, А-120, Т-1.15, ПЦР продукта по 12 мкл, М (50 п.н.) по 3,5 мкл, красителя по 5 мкл. Схема- 18-27, М 28-36 Примечания - цифрами сверху указаны номера исследуемых ДНК. Маркерный расчет (по линиям снизу на верх) – 50, 10, 150, 200, 300 и .т.д. пар нуклеотидов
Таким образом мы видим что искомый ген находится в сортах номер – 1, 3, 5, 16, 17, 23, 25, 29, 30, 31, 32, 37, поскольку линия выпадания данного гена будет находится на прямой линии проложенной с двенадцатой отметкой маркера в агарозном геле.
ПЦР с праймером Sr 32Исследовались 32 образца ДНК +Кч
|
|
master mix(х20) |
|
|
программа режим амплификации |
||||
|
|
1 |
20 |
35 |
|
|
SR 32 |
900 bp |
|
|
Н2О |
17.87 |
|
598,7 |
|
94⁰ - 3' |
|
|
|
|
Праймер F |
0,54 |
|
18.9 |
|
94⁰ - 1' |
˥ |
|
|
|
праймер R |
0,63 |
|
22,05 |
|
55⁰ - 1' |
} |
X45 |
|
|
10x bufer |
2,5 |
50 |
87,5 |
|
72⁰ - 2' |
˩ |
|
|
|
MgCl2 |
1,5 |
30 |
52,5 |
|
72⁰ - 10' |
|
|
|
|
dntp mix |
0,5 |
10 |
17,5 |
|
hold - 4⁰ |
|
|
|
|
Taq pol |
0,2 |
4 |
8 |
|
|
|
|
|
|
ДНК |
2 |
2 |
2 |
|
|
|
|
|
Объем мастер мих на 1 образец = 23 мкл + 2 мкл ДНК =25 мкл
Электрофорез
М 1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 14 15 16 17 18 Кч
Рис. 5. Электрофореграмма: Ген Sr 32, условия эксперимента - (85 мл ТБЕ+1,2г агара+3мкл бр эт), (900 bp), 20 слот, В-108, А-120, Т-1.25; ПЦР продукта по13мкл, М (100пн +50пн) -1,8 мкл, Схема М с 1по 17, Кч
Примечания - цифрами сверху указаны номера исследуемых ДНК. Маркерный расчет (по линиям снизу на верх) – 50, 10, 150, 200, 300 и .т.д. пар нуклеотидов
М 19 20 21 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 35 41 1 2 3 4
Рис. 6. Электрофореграмма Ген Sr 32, условия эксперимента - (85 мл ТБЕ+1,2г агара+3мкл бр эт), (900 bp), 20 слот, В-108, А-120, Т-1.25; ПЦР продукта по13мкл, М (100пн +50пн) -1,8 мкл, Схема М с 18по 32 (Sr 32), 1-4 (Yr 24)
Примечания - цифрами сверху указаны номера исследуемых ДНК. Маркерный расчет (по линиям снизу на верх) – 50, 10, 150, 200, 300 и .т.д. пар нуклеотидов
Таким образом мы видим что искомый ген отсутствует , поскольку линия выпадания данного гена будет находится на прямой линии проложенной с седьмой отметкой маркера в агарозном геле.
ПЦР с праймером Sr 33 Исследовалось 37 образцов ДНК + К + Кч
-
master mix(х20)
программа режим амплификации
1
20
40
SR 33
197 bp
Н2О
17.79
355,8
711,6
94⁰ - 3'
Праймер F
0,22
4,4
8,8
94⁰ - 1'
˥
праймер R
0,29
5,8
11,6
59⁰ - 1'
}
X45
10x bufer
2,5
50
100
72⁰ - 2'
˩
MgCl2
1,5
30
60
72⁰ - 10'
dntp mix
0,5
10
20
hold - 4⁰
Taq pol
0,2
4
8
ДНК
2
2
2
Объем мастер мих на 1 образец = 23 мкл + 2 мкл ДНК =25 мкл
Электрофорез:
1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 М К 12 13 14 15 16 17 18 19
Рис. 7. Электрофореграмма Ген Sr 33, условия эксперимента - (85 мл ТБЕ+1,2г агара), 20 слот В-105, А-120, Т-110 мин, ПЦР продукта по 12 мкл, М 2,5 мкл, красителя по 5 мк. Схема- 1-10, М, К, 11 - 18
Примечания - цифрами сверху указаны номера исследуемых ДНК. Маркерный расчет (по линиям снизу на верх) – 50, 10, 150, 200, 300 и .т.д. пар нуклеотидов
20 21 23 24 25 26 27 28 29 М К 30 31 32 33 34 35 36 38 39
Рис. 8. Электрофореграмма Ген Sr 33, условия эксперимента - (85 мл ТБЕ+1,2г агара), 20 слот В-105, А-120, Т-110 мин, ПЦР продукта по 12 мкл, М 2,5 мкл, красителя по 5 мк Схема- 19-27, М, К, 28 – 35
Примечания - цифрами сверху указаны номера исследуемых ДНК. Маркерный расчет (по линиям снизу на верх) – 50, 10, 150, 200, 300 и .т.д. пар нуклеотидов
Таким образом мы видим что искомый ген находится в сортах номер – 3, 6, 10, 25, 28, 31, , поскольку линия выпадания данного гена будет находится на прямой линии проложенной с четвертой отметкой маркера в агарозном геле.
ПЦР с праймером Yr 24 Исследовалось 32 образца ДНК + К + Кч ,
Объем мастер мих на 1 образец = 23 мкл + 2 мкл ДНК =25 мкл
-
master mix(х20)
программа режим амплификации
1
20
35
YR 24
258 bp
Н2О
585.1
94⁰ - 3'
Праймер F
0.93
32.7
94⁰ - 1'
˥
праймер R
0.62
21.7
55⁰ - 1'
}
X45
10x bufer
2,5
50
87,5
72⁰ - 2'
˩
MgCl2
1,5
30
52,5
72⁰ - 10'
dntp mix
0,5
10
17,5
hold - 4⁰
Taq pol
0,2
4
8
ДНК
2
2
2
Электрофорез:
М 1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 кч
Рис. 9. Электрофореграмма Ген Yr 24, (85 мл ТБЕ+1,2г агара), (258 bp), 20 слот, В-108, А-120, Т-1.25; ПЦР продукта по13мкл, М (100пн +50пн) -1,8 мкл, Схема М с 1по 17, кч
Примечания - цифрами сверху указаны номера исследуемых ДНК. Маркерный расчет (по линиям снизу на верх) – 50, 10, 150, 200, 300 и .т.д. пар нуклеотидов
М 20 21 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 35 41
Рис. 10. Электрофореграмма Ген Yr 24, (85 мл ТБЕ+1,2г агара+3мкл бр эт), 20 слот, В-108, А-120, Т-1.25; ПЦР продукта по13мкл, М -1,8 мкл, Схема М с 19 по 32,
Примечания - цифрами сверху указаны номера исследуемых ДНК. Маркерный расчет (по линиям снизу на верх) – 50, 10, 150, 200, 300 и .т.д. пар нуклеотидов
Таким образом мы видим что искомый ген находится в сортах номер – 3, 4, 6, 25, 28 поскольку линия выпадания данного гена будет находится на прямой линии проложенной на пару миллиметров ниже пятой отметки маркера в агарозном геле.
ПЦР с праймером Yr 17 Исследовалось 34 образца ДНК +К+ К +Кч ,
|
|
master mix(х20) |
|
|
программа режим амплификации |
||||
|
|
1 |
20 |
35 |
|
|
Yr 17 |
259 bp |
|
|
Н2О |
|
|
587,6 |
|
94⁰ - 3' |
|
|
|
|
Праймер F |
|
|
32,1 |
|
94⁰ - 1' |
˥ |
|
|
|
праймер R |
|
|
19,8 |
|
60⁰ - 1' |
} |
X40 |
|
|
10x bufer |
2,5 |
50 |
87,5 |
|
72⁰ - 2' |
˩ |
|
|
|
MgCl2 |
1,5 |
30 |
52,5 |
|
72⁰ - 10' |
|
|
|
|
dntp mix |
0,5 |
10 |
17,5 |
|
hold - 4⁰ |
|
|
|
|
Taq pol |
0,2 |
4 |
8 |
|
|
|
|
|
|
ДНК |
2 |
2 |
2 |
|
|
|
|
|
Электрофорез:
М 1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Рис. 11. Электрофореграмма: Ген Yr 17, (85 мл ТБЕ+1,2г агара) условия эксперимента - 20 слот, В-110, А-120, Т-1.15, ПЦР продукта по 13 мкл, М(50 п.н.) по 1,5 мкл, красителя по 3 мкл. Схема - М - 1-19, №8 и 10 только по 5мкл
Примечания - цифрами сверху указаны номера исследуемых ДНК. Маркерный расчет (по линиям снизу на верх) – 50, 10, 150, 200, 250 и .т.д. пар нуклеотидов
М50 18 19 20 21 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 35 41 Кгс Кгн
Рис. 12. Электрофореграмма Yr 17, (85 мл ТБЕ+1,2г агара), условия эксперимента -
20 слот, В-105, А-120, Т-1.30, ПЦР продукта по 13 мкл, М (50 п.н.) по 1,5 мкл, красителя по 3 мкл. Схема - М (50 пн ) – 2,5 мкл; 17 32,31
Примечания - цифрами сверху указаны номера исследуемых ДНК. Маркерный расчет (по линиям снизу на верх) – 50, 10, 150, 200, 250 и .т.д. пар нуклеотидов
Таким образом мы видим что искомый ген отсутствует поскольку линия выпадания данного гена будет находится на прямой линии проложенной на пятой отметки маркера в агарозном геле.
ПЦР с праймером Lr 19, исследовалось 34 образца ДНК К +Кч
Объем мастер мих на 1 образец = 23 мкл + 2 мкл ДНК =25 мкл
|
|
master mix(х20) |
|
|
программа режим амплификации |
||||
|
|
1 |
20 |
35 |
|
|
LR 19 |
130 bp |
|
|
Н2О |
|
|
607 |
|
94⁰ - 3' |
|
|
|
|
Праймер F |
0.3 |
|
10.9 |
|
94⁰ - 1' |
˥ |
|
|
|
праймер R |
0.6 |
|
21.6 |
|
60⁰ - 1' |
} |
X40 |
|
|
10x bufer |
2,5 |
50 |
87,5 |
|
72⁰ - 2' |
˩ |
|
|
|
MgCl2 |
1,5 |
30 |
52,5 |
|
72⁰ - 10' |
|
|
|
|
dntp mix |
0,5 |
10 |
17,5 |
|
hold - 4⁰ |
|
|
|
|
Taq pol |
0,2 |
4 |
8 |
|
|
|
|
|
|
ДНК |
2 |
2 |
2 |
|
|
|
|
|
Электрофорез
М50 1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Кг
Рис. 13. Электрофореграмма: Lr 19 (85 мл ТБЕ+1,2г агара+3мкл бр эт), 20 слот, В-108, А-120, Т-1.25 ПЦР продукта по 13 мкл, М (100 пн + 50 п.н.) по 1,8 мкл, красителя по 3 мкл. Схема - М - 1-18, 33
Примечания - цифрами сверху указаны номера исследуемых ДНК. Маркерный расчет (по линиям снизу на верх) – 50, 10, 150, 200, 250 и .т.д. пар нуклеотидов
Таким образом мы видим что искомый ген отсутствует поскольку линия выпадания данного гена будет находится на прямой линии проложенной между
третьей и четвертой отметкой маркера в агарозном геле.