Ado_A_D_Patologicheskaya_fiziologia

ном слое ведет к угнетению, а затем к инверсии работы 3№ + /Са 2 + ионо­ обменного механизма, следовательно, уменьшается отток Са2 + из клетки в обмен на входящие № + . Также происходит снижение электрического потенциала мембраны митохондрий, что влечет за собой уменьшение, а затем и потерю способности митохондрий аккумулировать внутриклеточ­ ный кальций.

Повышение концентрации ионов кальция в клетке вызывает актива­ цию протеаз и фосфолипаз, что приводит к гидролизу фосфолипидов мембраны, нарушению их структуры и функции. В результате становятся более выраженными нарушения кальциевого обмена, ускоряются процес­ сы накопления кальция в клетке. Образование такого порочного круга в итоге вызывает серьезные функциональные нарушения, а затем и гибель клетки. В дополнение к этому накопление №+ и Са2 + в клетке увеличивает осмолярность цитоплазмы, что влечет за собой приток воды в клетку и формирование гипоксического отека тканей.

При гипоксии в различных тканях выявлено увеличение продукции оксида азота. Умеренная активация эндотелиальной и нейрональной N0синтазы, видимо, имеет адаптивное значение: умеренная активация про­ дукции N0 сопровождается расширением прекапиллярных сосудов, снижением адгезии и агрегацией тромбоцитов, активацией синтеза стресс-белков, защищающих клетку от повреждений. Однако гиперпро­ дукция оксида азота оказывает повреждающее действие, особенно на нервные клетки. К тому же гипоксия нервной ткани увеличивает секре­ цию глутамата, который оказывает не только возбуждающее медиаторное, но и цитотоксическое действие, вызывая гибель нейронов.

Чувствительность различных тканей к недостатку кислорода неоди­ накова: в первую очередь при гипоксии страдает нервная система. Перво­ начальное эмоциональное и двигательное возбуждение (состояние эйфо­ рии) при длительной и глубокой гипоксии сменяется генерализованным торможением, адинамией; возникают грубые нарушения высшей нервной деятельности вплоть до потери сознания.

10.4.Коррекция гипоксии: необходим избыток или недостаток кислорода?

Поскольку гипоксия обусловлена уменьшением кислородоснабжения тканей, представлялась вполне естественной коррекция гипоксических состояний путем обогащения вдыхаемого воздуха кислородом. Дейст­ вительно, гипербарическая оксигенация, дыхание газовыми смесями с увеличенным содержанием кислорода весьма эффективны при глубокой циркуляторной гипоксии, когда компенсаторно-приспособительные ре­ акции практически полностью исчерпаны.

Однако нельзя забывать, что кислород является мощным окислите­ лем, его избыток токсичен для организма. Поэтому в случаях умеренной гипоксии разного происхождения применяют периодическое дыхание газовыми смесями с содержанием 10—12 % кислорода.

288

Глава 11. Механизмы опухолевого роста

Клеточное размножение — фундаментальный биологический про­ цесс, обеспечивающий преемственность поколений, образование мно­ гоклеточных организмов на ранних стадиях их развития, гомеостаз уже сформированных органов и тканей. В последнем случае имеется в виду постоянное (хотя и в разной степени выраженное) обновление всех тка­ ней, поддерживаемое балансом процессов клеточной гибели (апоптоз) и клеточного размножения (пролиферация).

В организме человека ежедневно гибнут и рождаются десятки мил­ лиардов клеток. Координировать эти процессы в «интересах» организма призвана чрезвычайно сложная система регуляции, которая включает, в частности, множество гуморальных факторов, секретируемых во внутрен­ нюю среду организма специализированными органами (эндокринная ре­ гуляция) и отдельными клетками (паракринная регуляция). Эти факторы могут оказывать как стимулирующее, так и тормозящее воздействие на процесс клеточного деления. Его «мишенями», как правило, могут быть не все клетки, а лишь те, которые имеют на своей поверхности особые структуры — рецепторы, способные воспринимать этот стимул и переда­ вать его во внутреннюю среду клетки. Этот так называемый митогенный сигнал индуцирует каскад биохимических реакций (в основном фосфорилирования) и как итог — вхождение клетки в цикл деления. Напротив, факторы, блокирующие клеточное размножение, индуцируют выход клет­ ки из цикла.

Принципиально таким же способом реализуется и феномен клеточ­ ной гибели — одни клетки секретируют, а другие воспринимают факто­ ры, побуждающие их к «самоубийству», которое осуществляется в резуль­ тате множества строго координированных биохимических реакций. Трудно переоценить значение апоптоза — именно таким способом орга­ низм избавляется от стареющих и функционально дефектных клеток, не­ сущих потенциальную угрозу ракового перерождения.

Нарушение этой сложной системы регуляции на любом ее этапе может привести к опухолевой трансформации, т.е. к нерегулируемому (не подчиняющемуся сигналам) клеточному размножению. Таким образом, установлено, что, во-первых, существует много причин ракового пере­ рождения клетки, и, во-вторых, рост опухоли может быть обусловлен как усилением клеточного размножения, так и ослаблением клеточной гибе­ ли. По достижении числа клеток, превышающего некий критический уро­ вень, возникает опухоль, развивающаяся по своим особым законам и ста­ новящаяся более автономной и злокачественной.

290

Детальное выяснение механизма клеточного деления, с одной сто­ роны, и опухолевой трансформации клетки — с другой, стало возможным только в последней четверти XX в. Основными предпосылками для этого были расшифровка структуры, функции и регуляции гена, развитие ген­ ной и клеточной инженерии, компьютеризация научного поиска. Очень важно и то обстоятельство, что фундаментальные биологические процес­ сы чрезвычайно консервативны и сохраняют свои основные черты у эволюционно далеких видов. Это позволяет использовать в исследованиях наряду с традиционными экспериментальными животными более простые

идоступные анализу организмы (дрозофила, дрожжи, нематоды и т.п.).

11.1.Механизмы клеточного деления

Эндокринная, паракринная и аутокринная регуляция. В норме клетки делятся исключительно под воздействием различных факторов внутренней среды организма (и внешних — по отношению к клетке). В этом состоит их коренное отличие от трансформированных клеток, деля­ щихся под воздействием эндогенных стимулов. Существуют два типа физиологической регуляции — эндокринная и паракринная. Эндокринная регуляция осуществляется специализированными органами (железами внутренней секреции), в числе которых гипофиз, надпочечники, щитовид­ ная, паращитовидная, поджелудочная и половые железы. Они секрети­ руют продукты своей активности в кровь и оказывают генерализованное воздействие на весь организм.

Паракринная регуляция характеризуется тем, что в одной и той же ткани соседние клетки воздействуют друг на друга посредством секретируемых и распространяющихся диффузией активных веществ. К числу таких митогенных стимуляторов (полипептидные ростовые факторы) относятся эпидермальный фактор роста, фактор роста тромбоцитов, ин- терлейкин-2 (фактор роста Т-клеток), фактор роста нервов и множество других.

Аутокринная регуляция, характерная для опухолевых клеток, отли­ чается от паракринной тем, что одна и та же клетка является и источни­ ком ростового фактора, и его мишенью. Результат — непрекращающееся, самоподдерживающееся митогенное «возбуждение» клетки, приводящее к нерегулируемому размножению. При этом клетка не нуждается во вне­ шних митогенных стимулах и становится полностью автономной.

Перенос митогенного сигнала — процесс многоэтапный. В зави­ симости от типа клетки и от конкретного митогенного стимула реализу­ ется один из множества сигнальных путей. Ниже в качестве «прототипа» описан так называемый МАР-киназный каскад.

Ростовые факторы (регуляторы пролиферации) секретируются одними клетками и действуют паракринным образом на другие. Это не­ большие белки. Полипептидная цепь EGF (epidermal growth factor) состоит, например, из 53 аминокислот. Существует несколько семейств ростовых

291

факторов, представитель каждого из которых объединен структурным и функциональным сходством. Одни из них стимулируют пролиферацию (например, EGF и PDGF, platelet-derived growth factor, тромбоцитарный фактор роста), а другие (TGF-p, TNF, интерфероны) — подавляют.

Рецепторы расположены на клеточной поверхности. Каждая клет­ ка имеет присущий ей репертуар рецепторов и соответственно свой осо­ бый набор ответных реакций. Очень важное в функциональном отноше­ нии семейство образуют так называемые тирозинкиназные рецепторы (ТКР), обладающие ферментативной (протеинкиназной) активностью. Они состоят из нескольких доменов (структурно-функциональных блоков): внеклеточного (взаимодействующего с лигандом — в данном случае с ростовым фактором), трансмембранного и подмембранного, обладаю­ щего тирозинпротеинкиназной активностью. В зависимости от структу­ ры ТКР подразделяют на несколько субклассов.

При связывании с ростовыми факторами (например, EGF) молеку­ лы рецепторов димеризуются, их внутриклеточные домены сближаются и индуцируют межмолекулярное автофосфорилирование по тирозину. Этоттрансмембранный перенос сигнала — начало волны «возбуждения», распространяющейся затем в виде каскада реакций фосфорилирования внутрь клетки и достигающей в итоге хромосомного аппарата ядра. ТКР обладают тирозинкиназной активностью, но по мере продвижения сиг­ нала внутрь клетки тип фосфорилирования меняется на серин/треониновый.

Ras-белки. Одним из наиболее важных является сигнальный путь с участием Ras белков (это подсемейство так называемых G-белков, обра­ зующих комплексы с гуаниловыми нуклеотидами; Ras-GTP — активная форма, Ras-GDP — неактивная). Этот путь — один из основных в регуля­ ции клеточного деления у высших эукариот — настолько консервативен, что его компоненты способны заменить соответствующие гомологи в клет­ ках дрозофилы, дрожжей и нематод. Он опосредует многочисленные сиг­ налы, исходящие из окружающей среды, и функционирует, по-видимо­ му, в каждой клетке организма. Ras играет роль своеобразного турникета, через который должен пройти почти любой из поступающих в клетку сиг­ налов. Критическая роль этого белка в регуляции клеточного деления из­ вестна с середины 80-х годов, когда активированная форма соответству­ ющего гена (онкоген Ras*) была обнаружена во многих опухолях человека. Активация онкогена (онкогены — гены, вызывающие нерегулируемое кле­ точное деление) — одно из главных событий канцерогенеза. Это такое повреждение нормального, участвующего в регуляции клеточного размно­ жения гена (протоонкогена — нормального клеточного гена, способного при нарушении структуры индуцировать опухолевый рост), которое де-

* Названия онкогенов в ряде случаев (ноне всегда) происходят оттехретровирусов, в которых они были первоначально обнаружены, и, как правило, не отражают их функционального назначения.

292

лает его перманентно работающим (активным) и, тем самым, индуциру­ ющим столь же непрерывное (нерегулируемое) клеточное деление. По­ скольку в регуляции клеточного размножения принимает участие мно­ жество клеточных генов (протоонкогенов), повреждение которых потенциально способно вызывать опухолевый рост, то соответственно существует и множество (несколько десятков, а возможно и сотен) онко­ генов.

В конкретной ситуации Ras-опосредованного сигнального пути (на­ пример, при взаимодействии EGF с рецептором) димеризация последнего приводит к автофосфорилированию одного из остатков тирозина в его подмембранном домене. В результате этого становится возможной са­ мосборка («рекрутирование» в комплекс) ряда белков, расположенных ниже в сигнальном пути (адаптерный белок Grb2, белок Sos1). Этот мультибелковый комплекс локализован в плазматической мембране.

МАР-киназный каскад. МАР-киназы (mitogen activated protein kinases) — серин/треониновые протеинкиназы, активируемые в резуль­ тате митогенной стимуляции клетки. Киназный каскад возникает как след­ ствие последовательной активации одного фермента другим, стоящим «выше» в сигнальном пути. Как следствие стимуляции белка Ras и фор­ мирования подмембранного комплекса повышается активность двух цитоплазматических серин/треониновых МАР-киназ (известных так же как ERK1 и ERK2, extracellular signal-regulated protein kinases 1 and 2), кото­ рые перемещаются из цитоплазмы в ядро клетки, где фосфорилируют ключевые факторы транскрипции — белки-регуляторы активности раз­ личных генов.

Активация транскрипции. Группа генов, определяющих вхождение клетки в фазу S, активируется транскрипционным фактором АР-1 — ком­ плексом белков Jun и Fos (гены, их кодирующие — c-Jun и c-Fos, отно­ сятся к числу протоонкогенов; с — от cell, обозначает их клеточное про­ исхождение в отличие от вирусных онкогенов v-Jun и v-Fos). Эти транскрипционные факторы могут взаимодействовать между собой с об­ разованием множества гомо- и гетеродимеров, связывающихся с опре­ деленными участками ДНК и стимулирующих синтез РНК на прилежащих к этим участкам генах. МАР-киназы повышают активность АР-1 двояким образом:

•опосредованным, активируя гены, кодирующие эти транскрипцион­ ные факторы, и увеличивая тем самым их содержание в клетке;

•прямым, фосфорилируя входящие в их состав сериновые и треониновые остатки.

Врезультате активации генов продуцируются белки, необходимые для синтеза ДНК и последующего митоза. Некоторые из новообразован­ ных белков (Fos, Jun, Мус), известные как белки раннего ответа (immediateearly proteins), выполняют регуляторные функции; связываясь со специ­ фическими участками ДНК, они активируют прилежащие гены. Другую группу составляют такие ферменты, как тимидинкиназа, рибонуклео-

293

тидредуктаза, дигидрофолатредуктаза, тимидилат-синтаза, орнитиндекарбоксилаза, ДНК-полимеразы, топоизомеразы и ферменты, которые имеют непосредственное отношение к синтезу ДНК. Кроме того, усили­ вается общий белковый синтез, поскольку при каждом цикле удвоения воспроизводятся все клеточные структуры.

Реализация митогенного сигнала. Результатом переноса митогенного сигнала является реализация сложной программы клеточного деления.

Клеточный цикл. Клетки могут находиться в одном из трех состоя­ ний — в цикле деления, в стадии покоя с сохранением возможности воз­ врата в цикл и, наконец, в стадии терминальной дифференцировки, при которой способность к делению полностью утрачена. Образовывать опу­ холи могут только те клетки, которые сохранили способность к делению.

Цикл удвоения разных клеток человека варьирует от 18 ч (клетки ко­ стного мозга) до 450 ч (клетки крипт толстой кишки), в среднем — 24 ч. Митоз (М) и синтез ДНК (фаза S), между которыми выделяют 2 промежу­ точных (gap) периода — G1 и G2, наиболее заметны; во время интерфазы (период между двумя делениями) клетка растет и готовится к митозу. В период фазы G1 существует момент (так называемая точка рестрикции R), когда осуществляется выбор между вхождением в следующий цикл деления или переходом в стадию покоя G0. Вхождение клетки в цикл де­ ления — процесс вероятностный, определяемый сочетанием ряда усло­ вий (внутренних и внешних); однако после того, как выбор сделан, по­ следующие этапы совершаются автоматически. Хотя клетка может блокироваться на той или иной стадии цикла деления, обычно это может быть следствием каких-то особых обстоятельств.

Особенно важными в цикле являются моменты вхождения клетки в фазу синтеза ДНК (граница фаз G/S) и митоз (граница фаз G2 /M), где действуют своеобразные «контрольно-пропускные пункты» (checkpoints), которые проверяют в первом случае целость ДНК (ее готовность к репли­ кации), а во втором — завершенность репликации. Клетки с поврежден­ ной или недореплицированной ДНК блокируются на границе соответству­ ющих фаз, что предотвращает возможность передачи потомству дефектов ее структуры в виде мутаций, делеций и иных нарушений. Некая система надзора, по-видимому, существующая в клетке, индуцирует систему ре­ парации ДНК, после завершения которой продвижение клетки по циклу может быть продолжено. Альтернативой репарации является апоптоз, радикальным образом устраняющий опасность возникновения в организ­ ме клона дефектных (потенциально опухолевых) клеток. Конкретный вы­ бор зависит от множества условий, в том числе от индивидуальных осо­ бенностей клетки.

Процесс репликации ДНК сложен и длителен (занимает несколько часов), поскольку весь генетический материал клетки должен быть вос­ произведен абсолютно точно. При возникновении в нем каких-либо от­ клонений клетка блокируется на подходе к митозу (на границе фаз G2/M)

294

и также может подвергнуться апоптозу. Защитное значение checkpoints трудно переоценить, поскольку их функциональные дефекты в конечном итоге имеют следствием и опухолевую трансформацию клетки и прогрес­ сию уже сформировавшейся опухоли.

Циклические реакции. Существуют два семейства белков, «движу­ щих» клеточный цикл — циклин(сусНп)-зависимые серин/треониновые протеинкиназы (Cdk, cyclin-dependent kinases) и сами циклины. Циклины регулируют активность Cdk и тем самым их способность модифициро­ вать структуры-мишени, непосредственно участвующие в метаморфозах цикла. С их участием осуществляются такие важные этапы цикла, как де­ зинтеграция ядерной мембраны, конденсация хроматина, формирование веретена и ряд других. Cdk активны только в комплексе с одним из циклинов. В связи с этим сборка и активация многочисленных комплексов Cdkcyclin, а также их диссоциация — ключевые моменты клеточного цикла.

Как следует из их названия, циклины синтезируются и распадаются в строго определенные моменты цикла, различные для разных циклинов. Имеется три основных их класса: й^циклины, необходимые для прохож­ дения GyS, S-циклины — для прохождения S-фазы и G2 (или митотические) — циклины для вхождения в митоз. В клетках млекопитающих име­ ется также несколько семейств Cdk, участвующих в разных регуляторных влияниях. Удаление того или иного циклина из внутриклеточной среды строго в определенный момент столь же важно, как и его появление (уст­ ранение циклинов из внутриклеточной среды достигается как их дегра­ дацией, так и блоком синтеза), например в митозе (на границе мета- и анафазы) в результате протеолиза один из циклинов быстро деградиру­ ет; если же этого не происходит, то митоз не может завершиться и разде­ ления дочерних клеток не происходит.

Продвижение в фазе S требует активации киназ Cdk2, Cdk4 и Cdk6, которые взаимодействуют с в^фазными циклинами (в частности, с cyclin D). Комплекс Cdc2 с первым й^фазным циклином индуцируеттранскрипцию гена следующего циклина и т.д., продвигая клетки все дальше по цик­ лу. Cdc2-cyclin D в самом начале замещается на Cdc2-cyclin Е, а тот в свою очередь — на Cdc2-cyclin А, активирующий аппарат синтеза ДНК. Когда клетка входит в S-фазу, й^циклины деградируют и появляются вновь лишь в фазе G1 следующего цикла.

Контрольно-пропускные пункты (checkpoints — англ.). Любое стрессорное воздействие (например, отсутствие питательных веществ, гипоксия, особенно повреждение ДНК) блокирует движение'по циклу в одном из двух упомянутых выше контрольных пунктов (checkpoints). Во время этих остановок активируются механизмы надзора, способные:

•обнаружить повреждение ДНК;

•передать сигнал неблагополучия, блокирующий синтез ДНК или митоз;

•активировать механизмы репарации ДНК.

295

Благодаря этому обеспечивается стабильность генома. Как упоми­ налось выше, механизм контроля G/S блокирует репликацию ДНК и ак­ тивирует процессы репарации (или индуцирует апоптоз), тогда как меха­ низм контроля G2 /M запрещает митоз до завершения репликации Дефекты этих механизмов могут привести к появлению дочерних клеток

споврежденным геномом.

Вмеханизме checkpoint участвуют комплексы Cdk-cyclin и ряд допол­ нительных белков — Rb, р53 и другие. Их совокупность образует систему «тормозов», не позволяющих клетке делиться в отсутствие адекватных стимулов. Гены, кодирующие эти белки, называют генами-супрессора- ми. Особая значимость этой системы заключается в том, что раковая

трансформация клетки становится возможной лишь после ее инактива­

ции. В соматической клетке существуют по два аллеля каждого из генов, втом числе и генов-супрессоров, и, следовательно, для их инактивации необходимы два независимых события (например, делеция одного алле­ ля и мутация другого). Именно по этой причине «спорадические» опухоли появляются относительно редко (вероятность возникновения в одной клетке нескольких независимых мутаций, причем поражающих один и тот же локус обеих хромосом, относительно невелика), а «семейные» чрез­ вычайно часты (в «раковых» семействах один из двух наследуемых алле­ лей того или иного гена-супрессора исходно дефектен). В последнем слу­ чае система «тормозов» у всех клеток данного организма обеспечивается лишь одним нормальным аллелем, что резко снижает ее надежность и повышает риск возникновения опухоли. Именно это и происходит при наследственной ретинобластоме (делеция одного аллеля Rb) и других наследственных синдромах (делеция или повреждение одного аллеля р53 или других генов-супрессоров).

У клеток с дефектным или отсутствующим белком-супрессором р53 контрольный пункт GyS неполноценен. Это проявляется в том, что повреж­ дения ДНК, индуцированные ионизирующей радиацией или каким-либо другим способом, не приводят ни к задержке клеток на границе фаз G 1/S, ни капоптозу. В результате в популяции накапливаются клетки с мно­ жественными нарушениями структуры ДНК; появляется и со временем нарастает нестабильность генома, которая способствует возникновению новых клеточных клонов. Их естественный отбор лежит в основе опухоле­ вой прогрессии — постоянного «дрейфа» опухоли ко все большей авто­ номности и злокачественности.

Апоптоз (или программируемая клеточная гибель) — широко рас­ пространенный биологический феномен клеточного «самоубийства», ко­ торое индуцируется либо разнообразными внешними стимулами, либо неразрешимыми «внутренними» конфликтами (например, невозможнос­ тью репарации повреждений ДНК). Роль апоптоза велика не только в фор­ мообразовательных процессах во время эмбриогенеза (формирование органов, замена одних тканей другими, резорбция временных органов и т.д.), но и в поддержании тканевого гомеостаза во взрослом организме.

296

В регуляции тканевого гомеостаза гибель клетки выполняет функцию, комплементарную митозу. У опухолевых клеток программа гибели клеток в большинстве случаев блокирована, что вносит существенный вклад в увеличение массы опухоли.

Механизмы апоптоза. Принципиальное значение имеет тот факт, что механизмы апоптоза чрезвычайно консервативны и сохраняют свои основные закономерности у весьма далеких в эволюционном отношении организмов. Это обстоятельство позволило идентифицировать у млеко­ питающих (в частности у человека) гены, гомологичные генам апоптоза у нематоды, — организма, у которого впервые была обнаружена и изучена генетическая система, управляющая этим процессом.

В результате у млекопитающих были идентифицированы гены се­ мейства Вс1-2. Роль самого Вс1-2 и некоторых его гомологов — антиапоптическая (предотвращение гибели клеток), тогда как у других членов се­ мейства, например Вах, — проапоптическая. Белки Вах и Вс1-2 способны к комплексообразованию друг с другом. В зависимости от относительно­ го внутриклеточного содержания про- и антиапоптических белков реша­ ется судьба данной клетки. Механизм действия белков семейства Вс1-2 не до конца ясен.

Большое функциональное значение имеет механизм апоптоза, ин­ дуцируемого через специфические рецепторы CD95 (трансмембранный белок-рецептор размером 45 кДа, который при связывании со специфи­ ческим лигандом или антителами передает сигнал к апоптозу) и TNF-R (tumor necrosis factor receptor, рецептор фактора некроза опухолей). Эти рецепторы, объединяемые сходством внеклеточных доменов, входят в состав большого семейства. Лигандами (молекулами, специфически вза­ имодействующими с рецепторами TNF-R и CD95) являются соответствен­ но TNF и CD95-L, которые представляют собой трансмембранные белки, но могут функционировать и в растворимой, «свободной» форме. Осо­ бенно интересен, с онкологической точки зрения, TNF — цитокин, произ­ водимый многими клетками (макрофагами, моноцитами, лимфоидными клетками, фибробластами) в ответ на воспаление, инфекцию и другие стрессорные воздействия. Он индуцирует широкий спектр иногда проти­ воположных по направленности реакций, включая лихорадку, шок, некроз опухоли, анорексию; а также иммунорегуляторные сдвиги, клеточное раз­ множение, дифференцировку и апоптоз. В этом случае апоптоз осуще­ ствляется с участием специфической цистеиновой протеазы ICE, разру­ шающей многие внутриклеточные белки-мишени. Гиперэкспрессия ICE в клетке вызывает апоптоз.

11.2. Патофизиология клеточного деления

«Базовые» (исполнительные) механизмы деления нормальной и опу­ холевой клетки одинаковы и осуществляются одними и теми же фермен­ тными системами. Различия же заключаются в регуляции этого процес­ са, в частности в тех стимулах, которые его «запускают».

297