Структура упаковочного контейнера:

Первичная емкость: емкость, содержащая пробу (пробирка с завинчивающейся проб­кой с нетоксичной резиновой прокладкой, обернутой лейкопластырем, или запаянная стеклянная ампула);

Внутренняя упаковка: - поглощающий материал — папиросная бумага или вата в количестве, достаточном для впитывания жидкости в случае утечки;

- пластиковый мешок, заполненный или заклеенный неволок­нистым лейкопластырем;

Наружная упаковка: -противоударная прокладка, (скомканная бумага или вата);- твердый водо­непроницаемый контейнер;- плотно пригнанная крышка, завинчиваемая или уплотняемая, заклеиваемая лейкопластырем или закрепляемая зажимами.

В качестве охлаж­дающей смеси используют смесь равных частей сухого льда (твер­дая углекислота) и этилового спирта, тогда температура минус 71 °С держится несколько дней. Можно использовать смесь, состоящую из трех весовых частей льда или снега и одной весовой части по­варенной соли. В последнем случае удается получить температуру минус 15... 20 °С. Вместо замораживания можно использовать хими­ческие консерванты, но это менее эффективно.

Лучшим из них считается смесь равных объемов стерильного глицерина и 0,85%-ного раствора поваренной соли (изотонический раствор). Обычно эту смесь рекомендуют использовать для консервирования кусоч­ков паренхиматозных органов и тканей.

Глицерин — это простейший трехатомный спирт. Он сме­шивается с большинством компонентов живой клетки. В него бы­стро диффундирует вода и электролиты, а сам он легко проникает в другие растворы и гели и не переходит в твердое состояние при низких температурах - минус 110 °С.

Растворы глицерина менее пригодны для вируссодержащих жидкостей, особенно в тех случаях, когда этот материал нужно вводить животным, эмбрионам и в культуру клеток в неразведён­ном виде. Употребление его делает невозможным исследование патологического материала методом иммунофлуоресценции, по­этому одновременно с пробой патматериала необходимо направить мазки-отпечатки, приготов­ленные и фиксированные на предметном стекле, для ис­следования на люминесцент­ном микроскопе.

П

Рис.1.

атматериал снабжают надежной и четкой этикеткой (рис.1.) недопустимо делать надписи карандашом по стек­лу. На пробирке или флакон­чике достаточно надежной является этикетка из лейко­пластыря, которую подписы­вают простым карандашом. На термос с пробами патма­териала навешивают бирку из картона или фанеры, на ко­торою указывают хозяйство, вид животного, вид материала и дату. Термос опечатывают. Взятый материал с сопроводитель­ным документом, содержащим полную информацию о животном, от которого взяты пробы, об эпизоотологических данных хозяйст­ва, предположительном диагнозе мерах, принятых для ликви­дации болезни (лечение, вакцинации и т.д.), а также дату и фа­милию ветеринарного врача, направляют с нарочным. Этими данными руководствуются при выборе направления лабораторных исследований. Доставленные в лаборатории пробы рекомендуется немедленно использовать для выделения вируса. Если по каким-то причинам (отсутствие экспериментальных животных, куриных эмбрионов, культур клеток) исследование откладывается, матери­ал хранят при температуре минус (40... 70) °С. Большинство вирусов в крови, спинномозговой жидкости, моче, соскобах и смывах носо­глотки быстро разрушается, а вирус парагриппа кр. рог. скота и респираторно-синцитиальный вирус быстро погибают при замо­раживании, поэтому успех их выделения зависит от быстроты ис­следования. Если нет уверенности в том, что исследуемое инфек­ционное заболевание было вызвано только вирусом, часть материала следует отдать для бактериологического и микологиче­ского исследований.

Подготовка вируссодержащего материала. В лаборатории полученный патматериал освобождают от консерванта, оттаивают, отмывают от глицерина, взвешивают или измеряют. Часть берут для вирусологического анализа, оставшуюся — хранят в холо­дильнике на случай необходимости дополнительных исследова­ний. Затем составляют план исследований присланного материа­ла.

Подготовку вируссодержещего материала для заражения чувствительных объектов осуществляют двумя методами: с помо­щью обработки антибиотиками или путем стерилизующего фильтрования.

Подготовка органов и тканей. Вирус необходимо высвобо­дить из клеток органов и тканей и перевести в раствор Хенкса. Для этого материал тщательно измельчают ножницами и расти­рают в ступке со стерильным кварцевым песком. Добавлять тол­ченое стекло менее желательно, так как оно обладает щелочными свойствами и может инактивировать часть вирусных частиц.

Но и на тонко растертых песчинках или частицах стекла, обладающих большой поверхностью, часть вируса может адсорбироваться и уйти затем в удаляемый осадок. Из растертого материала обычно готовят 10%-ную суспензию на растворе Хенкса. Полученную суспензию на растворе Хенкса центрифугируют при 1500...3000 об/мин в течение 15...30 мин, надосадочную жид­кость отсасывают в стерильные флаконы и освобождают от мик­рофлоры, либо пропуская через бактериальные фильтры (это де­лают редко, так как теряется много вируса за счет адсорбции на фильтре), либо обрабатывают антибиотиками широкого спектра действия (пенициллин, стрептомицин, нистатин, тетрациклин, кристалломицин и т.д.). Дозы антибиотиков, применяемых для этой цели, могут колебаться в довольно широких пределах (от 100 до 1...2 тыс. ЕД и более на 1 мл) в зависимости от характера ис­следуемого материала. Рекомендуют следующие дозы антибиоти­ков- пенициллина 1000 ЕД, тетрациклина 100 мкг, стрептомици­на 500 ЕД, нистатина 30 ЕД на 1 мл. Следует избегать излишне больших доз, так как их избыток при дальнейшем внесении в культуру клеток может вызвать неспецифическую дегенерацию последних. Предпочтительность тех или иных доз антибиотиков и оптимальный режим центрифугирования в каждом конкретном случае указан в инструкции по диагностике соответствующих ви­русных болезней.

Экспозиция суспензии с антибиотиками должна быть не ме­нее 30...60 мин при комнатной температуре, затем материал под­вергают бактериологическому контролю на наличие бактерий, грибов путем посева на МПА, МПБ, МППБ и среду Сабуро. После получения отрицательного результата бактериологического кон­троля вируссодержащий материал используют для заражения ла­бораторных животных, куриных эмбрионов и культур клеток. В случае положительного бактериологического контроля суспензию вируса подвергают дополнительной обработке антибиотиками и повторно ставят контроль. Суспензию хранят при минус (20... 70) °С.

Подготовка выделении из носа и глаз. Тампоны погружен­ные в соответствующий раствор, встряхивают 10...15 мин, тща­тельно отжимают, полученную жидкость центрифугируют 20 мин при 2000...3000 об/мин. Надосадочную жидкость отсасывают в стерильную пробирку и в нее добавляют пенициллин и стрепто­мицин по 500...1000 ЕД на 1 мл, выдерживают и после бактерио­логического контроля используют для заражения. Из осадка кле­ток готовят мазки для РИФ.

Подготовка фекалий. Пробу кала (приблизительно около 1 г) помещают в баночку с бусами, содержащую 10 мл раствора Хенкса. После гомогенизации материала встряхиванием и после­дующего центрифугирования при 2000...3000 об/мин в течение 30 мин надосадочную жидкость отсасывают, добавляют пеницил­лин, стрептомицин по 500... 1000 ЕД/мл, нистатин 30 ЕД/мл и тетрациклина 200 мкг/мл. После 30...60 мин контакта произво­дят посев на стерильность, замораживают и хранят при минус (10... 20) °С. В день заражения животных или культуры клеток исследуемый материал оттаивают и повторно центрифугируют для удаления вновь образующегося поле замораживания осадка. Не­использованный материал хранят в замороженном состоянии до конца исследований. Исследование кала может быть заменено ректальными мазками, обработка которых требует меньше време­ни, а частота выделения вируса при этом не только не меньше, но иногда выше.

Мочу обрабатывают антибиотиками 500...1000 ЕД/мл и ис­пользуют для заражения.

При кожных высыпаниях исследуют содержимое папул, пу­зырьков и пустул, чешуйки и корки. Содержимое папул и пу­зырьков разводят раствором Хенкса в соотношении 1:5, а корки, чешуйки после растирания суспендируют в солевом растворе 1:5-1:10 и подвергают центрифугированию при 2000...3000 об/мин в течение 10... 15 мин. После обработки пени­циллином и стрептомицином (по 200...500 ЕД/мл) материал ис­пользуют для заражения.

Подготовка крови. Для выделения вируса может быть ис­пользована цельная дефибринированная, "лаковая" кровь или кровь с антиксагулянтом. В последнем случае берут 5 мл крови в пробирку с 5-6 каплями гепарина и замораживают. После оттаи­вания гемолизированную кровь центрифугируют при 2000...3000 об/мин в течение 15 мин, добавляют пенициллин и стрепто­мицин из расчета 100... 200 ЕД/мл и после проверки на стериль­ность используют для заражения. Для этих целей пригодна и свернувшаяся кровь. Ее растирают в ступке и добавляют неболь­шое количество раствора Хенкса (1:1 или 1:2), а далее поступают аналогично.

Для освобождения вируссодержащего материала от микро­организмов применяют стерилизующее фильтрование. Чаще все­го используют асбестовые пластинки, керамические свечи, коллодийные мембраны и стеклянные фильтры. Асбестовые фильтры готовят из прессованного асбеста в виде кружков диаметром 35, 140 и 350 мм. Выпускают фильтры марки "Ф" (фильтрующие), задерживающие взвешенные частицы, но пропускающие частично бактерии, и "СФ" (стерилизующие), задерживающие все виды бактерий, не пропускающие вирусы.

Коллодийные мембраны (ультрафильтры) готовят из нитро­клетчатки (коллодия) с точно калиброванными порами. Иногда их называют градоколовыми фильтрами (англ. graduate — калиб­ровать; кол — от слова коллодий). Широкое распространение по­лучили мембранные фильтры. Для фильтрования вирусов исполь­зуют фильтры с диаметром пор 100-400 нм. В настоящее время мембранные фильтры являются наиболее совершенными.

Керамические свечи представляют собой удлиненной формы полые цилиндры, закрытые в нижней части (свечи Шамберлена, Беркефельда, каолиновые фильтры Санкт-Петербургского кера­мического НИИ). Их изготовляют из каолина с различной степе­нью порозности.

Стеклянные фильтры готовят из пористого стекла. В по­следние годы довольно широкое распространение получили фильтры Шота с пластинкой №5 из сплавленных мельчайших гранул отекла.

Суспензии, содержащие вирус, перед фильтрованием необ­ходимо освободить от грубой взвеси. Для этого их вначале цен­трифугируют в течение 10...15 мин при 1500...2000 об/мин и фильтруют через бумажный фильтр большой порозности (800 нм). Суспензия, подлежащая стерилизующему (заключительному) фильтрованию, должна быть прозрачной и лишь слегка опалесцирующей. Жидкость, хранившуюся на холоде, перед фильтровани­ем рекомендуется в течение часа выдержать при комнатной тем­пературе, а затем нужный ее объем вылить в стакан фильтровального прибора. В приемном сосуде (колбе) создают разрежение при помощи водоструйного или масляного насоса. Фильтрат проверяют на стерильность (наличие бактерий, грибов) путем посева на МПА, МПБ, среду Сабуро.

Следует отметить, что фильтрование сопровождается ад­сорбцией вируса на фильтре и приводит к его значительным поте­рям.

Отбор крови для серологических исследований. Для сероло­гической диагностики необходимо иметь две пробы сыворотки крови (парные сыворотки), взятые в начале и в конце болезни. Первую пробу берут как можно раньше — в инкубационный пе­риод или в начале проявления клинических симптомов болезни, вторую — во время выздоровления или через 2...3 недели после заболевания. Брать кровь и готовить сыворотку необходимо сте­рильно, нельзя применять энтикоагулянты или консерванты, ко­торые могут придать сыворотке антикомплементарность, а в ре­акции нейтрализации оказать инактивирующее действие на вирус, оказаться токсичными для культур клеток или просто не­стерильными. Кровь в объеме 10... 15 мл берут в стерильные про­бирки с резиновыми пробками, выдерживают при комнатной тем­пературе до образования сгустка, обводят стеклянной палочкой или другим инструментом и переносят в холодильник при 4 °С на 18... 20 ч. После максимальной ретракции сгустка сыворотку от­сасывают, добавляют пенициллин и стрептомицин по 100 ЕД/мл, проводят высевы на бактериологические среды. Вместо отстаива­ния в холодильнике можно после обведения кровь центрифугиро­вать.

Серологические методы вирусологической диагностики тре­буют исследования парных проб сывороток, поэтому необходимо правильно сохранять первые пробы, пока не будут получены вто­рые. Хранить сыворотки необходимо в холодильнике при 4 °С или в замороженном виде, строго соблюдая порядок нумерации проб и соответствия записей в журнале и на пробах.