149

6. Биологическое окисление

6.1. Общая характеристика

Под биологическим окислением понимают совокупность множества разнообразных окислительно-восстановительных реакций, совершающихся в биологических объектах под влиянием ферментов.

Процессы биологического окисления являются основным источником энергии в организме.

Современное представление о биологическом окислении основывается на классических теориях так называемой «активации» водорода В.И. Палладина и Виланда и «активации» кислорода А.Н. Баха и Варбурга.

Об окисляющем веществе говорят, имея в виду потерю им электронов (е¯) или одновременную потерю электронов и протонов(т.е. потерю водородных атомов) или, наконец, присоединение кислорода. Противоположное превращение вещества обозначается как его восстановление. Иногда для обозначения группы, принимающей участие в окислительно-восстановительном процессе. (т.е. электронов, протонов, кислорода) используют обобщенный, «нейтральный» термин: восстановительный эквивалент.

При решении вопроса, какое соединение из участников реакции является окислителем, а какое восстановителем, необходимо знать способность восстановителя отдавать электроны окислителю, что выражается величиной окисли- тельно-восстановительного потенциала (стандартного восстановительного потенциала, редокс-потенциала). Редокс-потенциал определяется путём измерения электродвижущей силы (э.д.с.) в вольтах, возникающий в полуэлементе, в котором восстановитель и окислитель, присутствующие в 1,0 М концентрациях при 25ºC и при рН 7,0, находятся в равновесии с электродом, способным обратимо принимать электроны от восстановителя.

В качестве стандарта принят редокс-потенциал реакции Нà 2Н+ + 2 е¯,

2

который при давлении газообразного водорода в1 атмосферу (760 мм рт. ст.), при 1,0 М концентрации ионов Н+ (что соответствует рН=0) и при 25ºC условно принят за нуль. В условиях физиологического значения рН, т.е. при рН=7,0 редокс-потенциал водородного электрода (системы Н2 – 2Н+) равен -0,42 вольта. Значения редокс-потенциала некоторых биологических окислительновосстановительных систем приведены в табл. 2.

Н2 à 2Н+ + 2 е- обладают большей, чем водород, способностью отдавать электроны, а у систем с более положительным редокс-потенциалом эта способность менее выражена, чем у водорода. Наибольший положительный редокс-

потенциал имеется в системе НO – 1/2O . Именно этим обстоятельством сле-

2 2

дует объяснить, что Н2О обладает очень слабой способностью отдавать электроны, тогда как молекулярный кислород характеризуется очень высоким сродством к электронам, превышающим такую у важнейших биологических акцепторов-переносчиков электронов НАД, НАДФ, ФМН, ФАД, цитохромы, участвующих в окислительно-восстановительных процессах в организме.

Величина редокс-потенциалов биологических окислительно-восстанови- тельных систем обусловливает направление переноса электронов от системы

Н – 2Н+ к системе Н О – 1/2О . Знание редокс-потенциалов различных биоло-

2 2 2

гических окислительно-восстановительных систем позволяет предсказывать направление потока электронов от одной системы к другой системе при ферментативном превращении веществ в процессе биологического окисления.

Установлено, что большинство биологических окислений в организме, приводящих к образованию конечных продуктов, осуществляется путем дегидрирования субстратов при участии специфических ферментов-дегидро- геназ. Отщепившийся водород присоединяется к тому или иному акцептору, что приводит к его восстановлению. Если роль акцептора выполняет не кислород, а какое-нибудь другое вещество, то говорят об анаэробном окислении. В

случае же, если акцептором водорода служит кислород, что приводит к образованию воды, биологическое окисление именуют аэробным окислением или тканевым дыханием. При тканевом дыхании происходит потребление кислорода с образованием конечных продуктов: Н2О и СО2. Для обозначения величины тканевого дыхания пользуются показателями Qо2 и Qсо2 определяемых c помощью манометрического метода на аппарате Варбурга. Qо2 обозначает количество микролитров кислорода, потребленного за 1 час при расчете на 1 мг сухого веса ткани, а Qсо2 – количество микролитров углекислоты, выделившейся в тех же условиях.

Конечными продуктами тканевого дыхания в случае окисления жиров и углеводов являются двуокись углерода и вода, а белков – СО2, Н2О и мочевина.

Следует сказать, что белки (протеины и протеиды), нуклеиновые кислоты, полисахариды, липиды не являются непосредственными субстратами биологического окисления. Субстраты биологического окисления образуются в процессе метаболизма в различной степени на разных его стадиях. Первичными субстратами биологического окисления являются аминокислоты, моносахариды, жирные кислоты, спирты, азотистые основания и др. продукты, образовавшиеся в результате ферментативного гидролиза высокомолекулярных -со единений – белков, полисахаридов, липидов, нуклеиновых кислот; иначе говоря, первичные субстраты окисления образуются на первой стадии катаболизма.

На последующих стадиях катаболизма в процессе расщепления веществ до конечных продуктов реакции окисления, катализируемые оксидоредуктазами, перемежаются с другими видами ферментативного преобразования -ве ществ.

Окисление, сопряженное с производством в организме энергии, почти во всех без исключения клетках проходит три стадии.

На первой стадии имеет место окислительное образование ацетилкоэнзима А из первичных субстратов биологического окисления– глюкозы, жирных кислот, аминокислот и др.

На второй стадии происходит расщепление ацетил-коэнзима А в лимоннокислом цикле. При этом в результате дегидрирования субстратов высвобождаются атомы водорода, восстанавливающие пиридинзависимые и флавинзависимые дегидрогеназы с образованием НАД.Н2, НАДФ.Н2, ФАД.Н2.

Кроме того, анаэробно путем декарбоксилирования субстратов образуется

СО2.

Третья стадия включает окисление НАД.Н2, НАДФ.Н2 и ФАД.Н2, т.е. перенос протонов и электронов на кислород с образованием воды и энергии в дыхательной цепи, состоящей из системы окислительно-восстановительных ферментов.

Следовательно, процесс биологического окисления можно представить как процесс дегидрирования с последующей передачей протонов и электронов через ряд промежуточных передатчиков на кислород с образованием воды.

На первой стадии биологического окисления образование - ацетил коэнзима А происходит различными путями в зависимости от вида первичных субстратов. Например, глюкоза путем гликолиза распадается до пировиноградной кислоты, а последняя – до ацетил-коэнзима А путем последующего окислительного декарбоксилирования пировиноградной кислоты; жирные кислоты превращаются в ацетил-коэнзим А путем β-окисления и т..дЭти специфичные пути соответствуют II стадии катаболизма и рассматриваются в соответствующих разделах обмена веществ(обмена углеводов, обмена жиров и др.).

Вторая стадия окисления, связанная с превращением ацетил-коэнзима-А в

лимоннокислом цикле, в результате которого образуется НАД.Н, НАДФ.Н и

2 2

ФАД.Н2, и третья стадия окисления, включающая окисление образовавшихся в лимоннокислом цикле восстановленных пиридинпротеидов и флавопротеидов (т.е. НАД.Н2, НАДФ.Н2, ФАД.Н2) в дыхательной цепи являются унифицированным общим участком биологического окисления, независимо от того, каким путем и от какого первичного субстрата образовался ацетил-коэнзим.-А Эти стадии биологического окисления соответствуютIII стадии катаболизма. Это так называемые центральные пути метаболизма (амфиболические пути).

6.2. Лимоннокислый цикл и окислительное декарбоксилирование пировиноградной кислоты

Детальное рассмотрение центральных путей метаболизма целесообразно начать с разбора предварительной реакции, поставляющей в лимоннокислый цикл ацетилкоэнзим-А – реакции образования ацетил-коэнзима А из пировиноградной кислоты. Эта важная подготовительная реакция лимоннокислого цикла непосредственно не входит в число реакций лимоннокислого цикла, но их совместное рассмотрение облегчает понимание важнейших аэробных превращений веществ в организме. При этом следует помнить, что в пировиноградную кислоту на второй стадии катаболизма (или первой стадии биологического окисления) превращаются многие вещества (моносахара, глицерин, 5 аминокислот) и таким образом, этап превращения пировиноградной кислоты в ацетил-КоА выступает как общий этап катаболизма для этих веществ.

Реакция образования ацетилкоэнзима-А из пировиноградной кислоты катализируется специальным ферментом – дегидрогеназой пировиноградной кислоты (пируватдегидрогеназной системой, локализованной внутри митохондрий). Это – мультиэнзимная система с М=4 млн. 500 тыс. состоящая из белковых субъединиц, образующих три апофермента (пируватдекарбоксилазу, ли-

поилредуктазуацетилтрансферазу и дигидролипоилдегидрогеназу), соединенных с различными коферментами– тиаминпирофосфатом, коэнзимом А, липоевой кислотой, ФАД и НАД. При этом коэнзим-А и НАД– внешние коферменты. Дегидрогеназа пировиноградной кислоты осуществляет как декарбоксилирование (с помощью пируватдекарбоксилазы), так и дегидрирование(с помощью липоилредуктазы – ацетилтрансферазы) пировиноградной кислоты. Этот процесс получил название окислительного декарбоксилирования пировиноградной кислоты. Суммарно весь процесс можно изобразить в виде:

Механизм окислительного декарбоксилирования пировиноградной кислоты сложен и состоит из нескольких фаз (пяти фаз или этапов). Первая фаза указанного комплексного процесса состоит в декарбоксилировании пировиноградной кислоты при участии тиаминпирофосфата в качестве кофермента пируватдекарбоксилазы:

фермент-субстратный комплекс

оксиэтилтиаминпирофосфат (ОЭТПФ)

Образовавшийся оксиэтилтиаминпирофосфат далее распадается с отщеплением и одновременным окислением оксиэтильного радикала при участии фермента липоилредуктазы – ацетилтрансферазы (иное название – дигидролипоилтрансацетилаза), несущего в качестве простетической группы остаток липоевой кислоты.

HS CH (CH2)4 COOH

дигидролипоевая кислота

Возникший при распаде оксиэтилтиаминпирофосфата ацетильный радикал присоединяется сначала к липоевой кислоте с образованием ацетилгидролипоевой кислоты (вторая фаза), а затем передается на коэнзим-А с образованием ацетилкоэнзима-А и дигидролипоевой кислоты(третья фаза). Далее при посредстве третьего компонента мультиэнзимного комплекса дигидролипоилдегидрогоназы, содержащего в качестве простетической группы ФАД, дигидролипоевая кислота переходит в липоевую кислоту, а ФАД восстанавливается (четвертая фаза).

Восстановленный ФАД дигидролипоилдегидрогеназы обладает исключительной способностью передавать атомы водорода окисленной форме НАД (пятая фаза):

Поэтому в приведенном выше суммарном уравнении окислительного декарбоксилирования пировиноградной кислоты в качестве акцептора атомов водорода выступает НАД.

Таким образом, в итоге окисления пировиноградной кислоты в ацетилко- энзим-А осуществляется одно декарбоксилирование и одно дегидрирование субстратов с приростом свободной энергии (~8,0 ккал, ~33,5 кДж). Поскольку окисление пировиноградной кислоты в ацетилкоэнзим-А– сильно экзергоническая реакция, в клетке она практически необратима.

Восстановленный пиридинпротеид (НАД.Н2) подвергается последующему окислению в дыхательной цепи.

Ацетилкоэнзим-А, несущий макроэргическую связь, энергично обменивается далее в лимоннокислом цикле.

Установлено, что пируватдегидрогеназная система может ингибироваться АТФ. Когда содержание АТФ в клетке начинает превышать определенный уровень, пируватдегидрогеназная система, поставляющая «топливо» для лимоннокислого цикла, выключается путем фосфорилирования с помощью протеинкиназы. Активация пируватдегидрогеназы стимулируется инсулином.

Лимоннокислый цикл (его также называют циклом трикарбоновых -ки слот, циклом ди- и трикарбоновых кислот, циклом Сент-Дьерди-Кребса, циклом Кребса, метаболическим котлом Кребса) занимает особое место в обмене веществ, так как является общим конечным путем окислительного катаболизма всех видов веществ в аэробных условиях.

Главная функция цикла заключается в дегидрировании уксусной кислоты (поступающей в цикл в виде ацетилкоэнзима ),Акоторое в конечном итоге приводит к образованию четырех пар атомов водорода и образованию двух молекул СО2, что можно выразить следующей суммарной реакцией:

СН3СООН + 2Н2О à 2СО2 + 8Н

Под действием фермента аконитазы(иначе его называют аконитатгидратазы) в реакции изомеризации лимонная кислота превращается в изолимонную, причем в качестве промежуточного продукта образуется цисаконитовая кислота. Аконитаза по своему механизму действия является одновременно и гидратазой и изомеразой:

В следующей реакции под действием фермента изоцитратдегидрогеназы изолимонная кислота дегидрируется в щавелево-янтарную кислоту. Имеются НАДФ- и НАД-зависимые изоцитратдегидрогеназы. НАД.Н2 или НАДФ.Н2 подвергаются последующему окислению в дыхательной цепи с приростом свободной энергии и аккумулированием ее в АТФ. Этот ферментный белок катализирует также реакцию декарбоксилирования щавелево-янтарной кислоты в α-кетоглутаровую кислоту, т.е., этот фермент обладает двойным действием. Поэтому его также называют изоцитратдегидрогеназа декарбоксилирующая. Для обеих реакций необходимы ионы Mg++ или Мn++. Изоцитратдегидрогеназа – аллостерический фермент, обычно лимитирующий скорость всего лимоннокислого цикла в целом. Фермент активируется АДФ и ингибируется

158 6. Биологическое окисление

АТФ, а также НАД.Н2, при накоплении их в клетке выше определенного уровня.

Следующая реакция– превращение α-кетоглутаровой кислоты в янтарную – происходит с помощью фермента α-кетоглутаратдегидрогеназы. Это реакция окислительного декарбоксилирования. Она протекает принципиально по тому же механизму, что и декарбоксилирование пировиноградной кислоты. При участии коэнзимов окислительного декарбоксилирования(тиаминпирофосфата, НS-КоА, липоевой кислоты, НАД, ФАД) возникает активный сукцинат, т.е. сукцинил-КоА. Для реакции необходимы ионы Мg++.

альфа-кетоглутаровая кислота (альфа-кетоглутарат)

НАД.Н.2 подвергается последующему окислению в дыхательной цепи с выделением энергии, аккумулируемой в процессе окислительного фосфорилирования в 3 молекулах АТФ.

Сукцинил-КоА затем расщепляется на янтарную кислоту и коэнзим А. Реакция катализируется ферментом сукцинаттиокиназой.

Энергия расщепления сукцинилкоэнзима-А накапливается в гуанозинтрифосфате.

ГТФ + АДФ ГДФ + АТФ

Вслед за этим в сопряженной реакции перефосфорилирования АДФ фосфорилируется в АТФ, так что освобождающаяся в реакции ГДФ может вновь фосфорилироваться. Таким образом энергия, выделяющаяся при окислении α- кетоглутарата, частично накапливается сначала в сукцинил-КоА и затем переносится через ГТФ на АТФ. Эта реакция является примером субстратного фосфорилирования. В α-кетоглутуратдегидрогеназной системе, следовательно, происходит образование 1-ой молекулы АТФ путем субстратного фосфорилирования и 3-х молекул АТФ путем окислительного фосфорилирования. Образовавшаяся янтарная кислота превращается в фумаровую кислоту:

Реакция катализируется ферментом сукцинатдегидрогеназой. Этот фермент очень активен во всех клетках, обладающих способностью поглощать кислород. Он прочно фиксирован в структуре митохондрий. Сукцинатдегидрогеназа в качестве простетической группы содержит производное флавина(ФАД) и кроме того – 4 атома негиминового железа (М=200 тыс.). Восстановленный ФАД в последующем окисляется в дыхательной цепи с выделением энергии, аккумулируемой в процессе окислительного фосфорилирования в2-х молекулах АТФ. Сукцинатдегидрогенза обладает свойствами аллостерического фермента, она активируется фосфатом, сукцинатом и фумаратом и конкурентно

ингибируется оксалоацетатом – последней дикарбоновой кислотой лимоннокислого цикла, накопление которой выше определенного уровня тормозит сукцинатдегидрогеназную реакцию.

Фумаровая кислота, образовавшаяся в результате окисления янтарной кислоты, с помощью фермента фумаратгидратазы(фумаразы) превращается далее в яблочную кислоту. Этот фермент очень специфичен, действует стереоспецифически, образуя только L-яблочную кислоту. Реакция легко обратима.

С помощью фермента малатдегидрогеназы яблочная кислота далее окисляется в щавелево-уксусную кислоту.

Хотя реакция носит эндергический характер, тем не менее в клетке она идет в прямом направлении, так как её продукты (оксалоацетат и восстановленный НАД) быстро удаляются. Оксалоацетат вступает в реакцию с новой молекулой ацетилкоэнзима-А, включающегося в лимоннокислый цикл, а НАД.Н2 окисляется в дыхательной цепи с аккумуляцией выделившейся энергии в 3-х молекулах АТФ.

Следовательно, с образованием вновь молекулы оксалоацетата цикл -за мыкается и по существу идет окисление ацетильных остатков, постоянно вносимых в лимоннокислый цикл в виде ацетилкоэнзима-А.

Лимоннокислый цикл – это каталитический механизм, при помощи которого осуществляется полное окисление не только ацетил-Ко-А и всех соединений, способных его образовать, но так же любого компонента цикла или любого соединения, способного превратиться в один из компонентов цикла. К примеру, существуют ферментативные реакции, обеспечивающие превращение некоторых аминокислот в субстраты лимоннокислого цикла: α-кетоглутарат, сукцинат, оксалоацетат и фумарат. Жирные кислоты с нечетным числом углеродных атомов превращаются через пропионил-КоА в сукцинил-КоА.

С другой стороны, лимоннокислый цикл поставляет исходные продукты для синтеза важных промежуточных продуктов метаболизма.

Все реакции лимоннокислого цикла более или менее обратимы. Однако, основное направление лимоннокислого цикла– его протекание в сторону образования щавелево-уксусной кислоты из лимонной через стадии цисаконитовой, изолимонной, щавелево-янтарной, α-кетоглутаровой, сукцинил-КоА, янтарной, фумаровой и яблочной кислот.

Благодаря наличию лимоннокислого цикла и сопряженной с ним дыхательной цепи происходит полное окисление уксусной кислоты(ацетилкоэнзи- ма-А) до СО2 и Н2О с образованием 205 ккал (858,8 кДж) свободной энергии.

В лимоннокислом цикле декарбоксилирование происходит на двух стадиях превращений: щавелево-янтарная кислота– α-кетоглутаровая кислота и α-кетоглутаровая кислота – сукцинил-КоА.

Необходимое количество молекул воды включается в двух реакциях гидратации (фумаровая кислота – яблочная кислота и цитрил-КоА – цитрат).

Прирост свободной энергии происходит в основном в четырех реакциях дегидрирования, которые поставляют основную часть энергии, благодаря последующему окислению водорода в дыхательной цепи. Это следующие реакции:

1)изолимонная – щавелево-янтарная кислоты;

2)α-кетоглутаровая – янтарная кислоты;

3)янтарная – фумаровая кислоты;

4)яблочная – щавелево-уксусная кислоты.

При окислении в лимоннокислом цикле в реакциях, сопряженных с дыхательной цепью ферментов одной молекулы уксусной кислоты в виде ацетилКоА образуется 12 молекул АТФ. Образование их происходит в уже указанных реакциях дегидрирования с последующим окислением атомов водорода в дыхательной цепи:

1)изолимонная кислота – щавелево-янтарная кислота – 3 мол. АТФ;

2)α-кетоглутаровая кислота – янтарная кислота – 4 мол. АТФ;

3)янтарная кислота – фумаровая кислота – 2 мол. АТФ;

4)яблочная кислота – щавелево-уксусная кислота – 3 мол. АТФ.

При окислении α-кетоглутаровой кислоты происходит образование1 молекулы АТФ путем субстратного фосфорилирования и3 молекул АТФ путем окислительного фосфорилирования в дыхательной цепи. При окислении янтарной кислоты выпадает одно фосфорилирование, так как водород субстрата переносится непосредственно на убихинон (Ко-Q, дыхательной цепи), поэтому при этой реакции образуется 2 молекулы АТФ.

Итак, четыре пары атомов водорода, снятые с субстратов в лимоннокис-

лом цикле, передаются с НАД.Н или ФАД.Н , на дыхательную цепь, локали-

2 2