101

4.Ферменты

4.1.Общее понятие о ферментах

Вещества белковой природы, биологическая функция которых состоит в катализе, т.е. ускорении течения химических реакций в организме, называются ферментами (от лат. ферментум – закваска) или энзимами (от греч. «эн» – внутри, «зим» – закваска).

Как говорит само происхождение названия этих веществ, начальные сведения об их существовании были получены при изучении процессов брожения. Первое вполне научное описание действия фермента было дано в 1914 г. петербургским ученым К.С. Кирхгоффом. Л. Пастер, связывая процесс брожения с действием ферментов, считал, что эти ферменты не отделимы от дрожжевых клеток и от всего того, что поддерживает клетку в живом состоянии. Лишь благодаря работам русских ученых М.М. Манассеиной, А.Н. Лебедева, а также Э. Бухнера, было доказано, что эти важнейшие ферменты, катализирующие основные метаболические процессы, могут функционировать вне клетки. Тем самым был положен конец виталистической теории брожения.

Наиболее крупные достижения в учении о ферментах принесXX век. В 1926 году Самнером был получен первый кристаллический фермент – уреаза и доказана его белковая природа. Самнер высказал мнение, что все ферменты являются белками. Белковая природа ферментов была окончательно выяснена после того, как Нортроп с сотрудниками выделили в кристаллическом виде пепсин, трипсин и химотрипсин.

К настоящему времени идентифицировано более двух тысяч различных ферментов, из которых около 200 ферментов получено в кристаллическом виде и изучены их свойства. В этом большая заслуга таких исследователей как А.Н. Бах, В.И. Палладин, Варбург, Вилланд, Самнер, Диксон, Уэбб, Кошланд и др.

Успехи, достигнутые в изучении строения и функции ферментов позволяют считать, что ферменты являются тем рабочим аппаратом, при помощи которого реализуется генетическая информация, зашифрованная в последовательности нуклеотидов ДНК.

Ферменты катализируют тысячи химических реакций, из которых слагается в организме обмен веществ и энергии.

При этом биокатализаторы (ферменты) отличаются исключительной эффективностью. При оптимальных условиях большинство ферментативных реакций протекает во много миллионов раз быстрее, чем те же реакции в отсутствии ферментов.

102 4. Ферменты

Число оборотов (т.е. число молекул субстрата, превращаемых за одну минуту, на одну молекулу фермента) для большинства ферментов равно приблизительно 1000, а в некоторых случаях может превышать 1 млн. Из всех известных ферментов максимальным числом оборотов обладает карбоангидраза, для которой оно составляет 36 млн.

Многие химические реакции, которые обычно протекают только при высоких температурах или только в сильно кислой или щелочной среде, в присутствии соответствующих ферментов могут идти быстро и количественно при комнатной температуре и при значениях рН, близких к нейтральному. К примеру, гидролитический распад белка до аминокислот в присутствии неорганических катализаторов (крепких кислот или щелочей) осуществляется при температуре 100°С и выше за несколько десятков часов. Этот же процесс при каталитическом участии специфических ферментов требует всего несколько десятков минут и идет при температуре 30-40°С.

Ферменты обеспечивают способность живых организмов осуществлять необходимые для их жизнедеятельности превращения веществ как поступающих из внешней среды, так и образующихся внутри организма. Питание организма, усвоение им веществ внешней среды происходит при участии ферментов, находящихся в пищеварительных соках, т.е. функционирующих внеклеточно. Дальнейшее использование питательных веществ клетками, освобождение химической энергии высокомолекулярных соединений в процессе биологического окисления и образование структурных элементов клеток и тканей в процессе их развития и дифференцировки совершается при обязательном участии внутриклеточных ферментов. Складываясь в единый ансамбль биохимических процессов, эти ферментативные реакции преобразования веществ составляют материальную и энергетическую основу жизнедеятельности организма. Поэтому ферменты заслуженно считают истинными двигателями всех жизненных процессов. Блокирование деятельности ферментов микробными токсинами и иными ядами ведет к гибели организма.

Благодаря контакту ферментов с лекарственными веществами в больном организме достигается такое изменение ферментативных процессов, которое способствует излечению от болезней. Стимулирование развития животных и растений, осуществляемое разнообразными препаратами, в большинстве случаев основано на действии их на те или иные ферменты.

В тончайших различиях строения ряда ферментов кроется причина видовых особенностей организмов, а в нарушении биосинтеза некоторых ферментов – исходное звено в возникновении наследственных и других заболеваний.

На свойстве ферментов сохранять свои специфические функции вне организма основано их практическое применение в медицине, химической, пищевой, легкой и фармацевтической промышленности.

В последние годы все большее применение в различных областях -про мышленности, в фармации, медицине получили искусственно иммобилизованные ферменты. Путем иммобилизации, т.е. связывания, фиксирования ряда ферментов на различных носителях (полиамиде, стекле, силастике, целлюлозе, полистироле, полиуретане, целлофане и др.) создаются нерастворимые катализаторы, которые не только сохраняют специфичность и активность типичных биокатализаторов, но и превышают их стойкостью и длительностью действия.

Иммобилизованные ферменты получили применение в непрерывных реакторах в химической промышленности и биотехнологических процессах. С их помощью созданы новые аналитические методы(афинная хроматография), повысилась эффективность медицинского применения ферментов. В частности, ферменты, включенные в микрокапсулы, липосомы и другие«контейнеры», используются для удаления из крови мочевины, возмещения врожденной ферментной недостаточности, терапии различных опухолей, растворении тромбов, используются в аппаратах «искусственная почка и печень» и для наработки коферментов и кофакторов, аминокислот, гормонов, антител, вакцин в мультимерных реакторах. Ферменты, включенные в волокна или трубки, используются в медицине в экстракорпоральных шунтах при терапии некоторых аспарагин-зависимых опухолей и для удаления вредных метаболитов из крови, а также при диагностических определениях. Разрабатывается использование

полых волокон с иммобилизованными ферментами в качестве капиллярных подложек в культурах клеток при решении проблем биотехнологического характера, для наработок гормонов, вирусов, вакцин и антител с целью их терапевтического или диагностического использования. Большие перспективы открываются для медицинского использования липосом(микропузырьков из фосфолипидов) с включенными в них ферментами. Их использование дает в ряде случаев уникальную возможность целенаправленного транспорта активного начала внутрь клетки. Использование иммобилизованных ферментов в составе липосом возможно для лечения многих наследственных, онкологических и сердечно-сосудистых заболеваний. Широки перспективы для клинического использования ферментов, связанных с водорастворимыми полимерами.

Уже достигнуты определенные успехи в использовании в клинике на пациентах иммобилизованных протеаз в качестве фибринолитических и противовоспалительных препаратов. Созданы на биодеградирующих носителях(гепарине, антителах и др.) препараты стрептокиназы, фибринолизина, трипсина, урокиназы. Особое значение приобрело применение препарата иммобилизованной стрептокиназы (стрептодеказы) для лечения инфаркта миокарда и тромбозов.

4.2. Выделение ферментов и определение их активности

Ферменты обычно присутствуют в тканях в малых количествах. Для изучения их строения и свойств требуется их извлечение из тканей особыми -ме тодами и очистка от сопутствующих веществ. Очень удобным источником извлечения некоторых ферментов являются пищеварительные соки животных и человека, поскольку их можно рассматривать как достаточно концентрированные водные растворы ферментов. Из тканей и органов животных и растительных организмов ферменты извлекают путем разрушения этих тканей(измельчением, растиранием с кварцевым или стеклянным песком, гомогенизацией и др.) на холоду с последующей экстракцией той или иной жидкостью: солевыми растворами или буферными смесями, спирто-солевыми смесями, глицерином, бутиловым спиртом. Чаще всего ферменты получают путем адсорбции (связывания на поверхности) с последующей элюцией(снятием с поверхности) с адсорбента. Этот метод был введен в химию ферментов А.Я. Данилевским и дал мощный толчок развитию ферментологии. Наряду с ним широко применяется метод ионообменной хроматографии, метод молекулярных сит и электрофорез. Словом, ферменты выделяют также, как и другие белки. Причем, при изучении ферментов окислительно-восстановительных процессов, биосинтеза белка и т.д. весьма важное значение приобрели методы дифференциального центрифугирования субклеточных структур– митохондрий, рибосом, ядер, гиалоплазмы, где эти ферменты сосредоточены. Особое внимание при выделении ферментов уделяют проведению всех операций в условиях, при которых была бы исключена денатурация белка, так как она всегда связана с потерей ферментативной активности.

О степени чистоты ферментативного препарата судят по его биологической активности. Если активность при дальнейшей обработке не возрастает, препараты можно считать гомогенными.

Наличие фермента обычно распознается по проявлениям катализируемой им химической реакции; количество присутствующего фермента можно определить путем измерения скорости этой реакции. Таким образом, о количестве фермента судят по его активности.

Активность ферментов определяется большим числом факторов, которые можно схематически подразделить на три группы:

1.Количество самого ферментного белка в клетке, т.е. уровень его биосинтеза.

2.Наличие факторов, изменяющих скорость ферментативной реакции, т.е. наличие субстратов, кофакторов, активаторов, ингибиторов, влияющих на конформацию апофермента, денатурирующих влияний, метаболическое взаимопревращение ферментов, величина температуры, гидратации, рН, осмолярности, наличие электролитов и т.д.

3. Локализация ферментов и зависящие от проницаемости мембран доступность субстратов ферментативному воздействию и скорость удаления продуктов ферментативной реакции.

Учитывая эту разностороннюю зависимость активности ферментов, определение активности ферментов проводят в буферных растворах, имеющих значение рН, близкое к оптимальному для данного фермента, при температуре в пределах 25-40°С (обычно при 37°С). В состав опытных смесей добавляют необходимые коферменты (в концентрациях, превышающих концентрацию насыщения), активаторы и стабилизаторы (последние препятствуют денатурации ферментативного белка). Используются концентрации субстрата, превышающие концентрацию насыщения. Основными современными методами определения активности ферментов являются спектрофотометрические, флюориметрические, полярографические, колориметрические, монометрические и др. В основном, эти методы определяют убыль субстрата или появление продуктов его ферментативного расщепления и дают оценку относительных количеств фермента. Однако с помощью спектрофотометрии и флюориметрии можно получать информацию об абсолютном количестве фермента(по степе-

ни поглощения растворами фермента лучей света с определенной длинной волны – в первом случае и по степени флюоресценции простетических групп фермента – во втором случае).

До недавнего времени в работах по определению активности ферментов не было единообразия ни в выборе условий измерения активности ферментов, ни в способе выражения единиц активности ферментов.

Комиссия по ферментам Международного биохимического союза в1961 году рекомендовала общие правила и величины, в которых выражается количество ферментов. Согласно этим рекомендациям за единицу(Е) фермента принимается такое его количество, которое катализирует превращение одного микромоля субстрата в минуту при25°С в оптимальных условиях. Удельная активность ферментного препарата выражается числом единиц ферментативной активности в расчете на 1 мг белка, а концентрация фермента в растворе– числом этих единиц на 1 мл раствора.

В дальнейшем комиссия по биохимической номенклатуре рекомендовала выражать скорость реакций в молях в секунду, придерживаясь единиц международной системы мер. Согласно рекомендациям международного биохимического союза (1972) и номенклатуре ферментов (1978) предложено вместо безымянной ферментной единицы ввести для выражения каталитической активности ферментов новую единицу под названием катал. Катал (символ – кат) есть каталитическая активность, способная осуществлять реакцию со скоростью, равной 1 молю субстрата в секунду, в заданной системе измерения активности.