Раздел 2. Методы диагностики
Клинико-анамнестический метод
При сборе анамнеза внимание уделяется течению беременности (наличие токсикозов, угроза прерывания беременности и др.) и родов (быстрые, стремительные, акушерские пособия, кесарево сечение и др.), длительности периода грудного вскармливания, выясняются особенности психомоторного развития ребенка с первых дней жизни, сведения о перенесенных заболеваниях. Особое значение при сборе анамнеза имеет выявление признаков, свидетельствующих о патологии желудочно-кишечного тракта: обстоятельств, при которых впервые появились боли в животе, учитывают их локализацию, связь с приемом пищи, сезонность появления, сочетание с теми или иными диспепсическими явлениями, наличие аллергических реакций в виде кожных сыпей, рино-конъюнктивального синдрома. Осуществляется анализ характера течения заболевания, эффективности проводимой терапии. Уделяется внимание частоте инфекционных заболеваний, а также срокам и эффективности применения антибиотиков. Для детей, постоянно проживающих в зоне повышенного радиационного воздействия вследствие аварии на Чернобыльской АЭС, кроме того уточняется длительность пребывания на загрязненной территории ребенка и его родителей, выясняется, подвергались ли они воздействию радиационного облучения и какова полученная суммарная доза.
Большое внимание должно уделяться наследственной предрасположенности к заболеваниям желудочно-кишечного тракта, наличию среди ближайших родственников, а также лиц, проживающих совместно с ребенком, больных язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки, онкологическими заболеваниями (выявление лимфомы и аденокарциномы).
На основании результатов собственных исследований и данных литературы среди факторов риска формирования HР-ассоциированных заболеваний у детей определяющим в инфицировании детей хеликобактером является генетическая предрасположенность, в частности, наследование механизмов противоинфекционной защиты. Не подлежит сомнению важность такого фактора риска, как инфицирование членов семьи и, прежде всего, родителей. Это подтверждается высокой частотой инфицирования в семьях, где матери страдают язвенной болезнью с выявлением штаммов микроорганизмов, генетически идентичных обнаруженным у больных детей.
Фиксируется социоэкономическое положение семьи (в том числе, жилищные условия), уровень санитарной культуры, возраст родителей, длительность пребывания ребенка в детском, в том числе учебно-воспитательном, учреждении.
Немаловажную роль в распространении Helicobacter pylori (НР) играет низкое качество питания. Известно, что дети, получающие соответствующее возрасту количество витамина С и -каротина в составе фруктов и овощей, менее подвержены инфицированию.
Как показывают данные, определенное значение имеют плохие санитарно-гигиенические условия, низкий социально-экономический уровень семьи. Инфицирование сходными штаммами НР наблюдается в интернатах для детей и домах престарелых, а также у лиц, работающих в одном учреждении, питающихся в общей столовой. При улучшении жизненных и санитарно-бытовых условий частота заражения снижается.
Зарегистрированы факты контаминации НР при использовании эндоскопического оборудования без соблюдения надлежащих правил обработки инструментария. При ужесточении контроля и правил стерилизации эндоскопов этот фактор риска перестал быть значимым.
Нарушения протективных механизмов органов пищеварения (слизистого барьера, системного и местного иммунитета, структуры микробиоценозов) являются, с нашей точки зрения, одним из важнейших факторов, способствующих инфицированию НР и формированию ассоциированной с ним патологии. Существуют объективные предпосылки считать, что безусловным фактором риска является наличие у ребенка синдрома мальабсорбции.
Клинический осмотр детей, взятие анализов крови и мочи, биохимическое исследование крови, рН-метрия проводят в соответствии с общепринятыми методами.
Эзофагогастродуоденофиброскопия
Эзофагогастродуоденофиброскопию проводят с применением аппаратов фирмы OLYMPUS – Япония (GIF-Р-3 и др.). Для местной анестезии обычно используют 5,0 мл 0,5% раствора дикаина. По показаниям во время процедуры производят прицельную биопсию слизистой оболочки антрального и фундального отделов желудка, в ряде случаев – и двенадцатиперстной кишки. При наличии клинических признаков нарушенного кишечного всасывания для верификации характера поражения дополнительно осуществляют еюнофиброскопию.
Биоптаты слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки исследуют гистологическими, морфометрическими, иммуногистохимическими и бактериоскопическими методами.
Морфологическое исследование биоптатов слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки
Морфологический анализ заключается в исследовании гистологических препаратов, окрашенных гематоксилин-эозином, пикрофуксином (по Ван Гизону), альциановым синим, толуидиновым синим (полутонкие срезы), а также оценивают ШИК-реакцию. Ультратонкие срезы предназначены для исследования в электронном микроскопе.
В срезах толщиной 5 мкм, окрашенных гематоксилином и эозином, помимо гистологической оценки препарата проводили морфометрические измерения. В lamina propriaслизистой оболочки определяют плотность клеток на 1 кв.мм ткани, абсолютное количество лимфоцитов, зрелых и незрелых плазматических клеток, моноцитов, тканевых макрофагов, эозинофилов, нейтрофилов, молодых и зрелых фибробластов. При изучении клеточного составаlamina propriaиспользуют классификацию А. Котье (1973).
Кроме того, измеряют высоту покровно-ямочного эпителия слизистой оболочки желудка, высоту ворсинок, глубину крипт, толщину слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки, отношение высоты ворсинок к глубине крипт и высоту ворсинок к толщине слизистой оболочки. Подсчитывают процентное содержание обкладочных клеток, межэпителиальных лимфоцитов в слизистой оболочке тела и антрального отдела желудка, бокаловидных клеток в ворсинках и криптах слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки, число эпителиальных клеток слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки в стадии митоза. Степень обсемененности слизистой оболочки НР определяют на основании международно признанной классификации 1996 года по специальной оценочной шкале (таблица).
Иммунологическое и иммуноморфологическое исследование
Прямым иммунофлуоресцентным методом по J.M. PolakиS.van Noorden(1984), используя специфические ФИТЦ-меченые антисыворотки, в срезах слизистой оболочки органов пищеварения выявляют клетки, продуцирующие иммуноглобулины классов А, М, G и Е, и оценивают их количество на 1 кв. мм площади.
Для объективизации количественных параметров IgE-содержащих клеток в слизистой оболочке желудка используют иммунопероксидазный метод. Для этого биоптаты из антрального и фундального отделов желудка в течение 2 часов фиксируют в жидкости Боуэна, затем на протяжении 24 часов обрабатывают 10% раствором формалина. Для блокирования эндогенной пероксидазной активности материал на 30 мин помещают в 0,5% раствор перекиси водорода в метаноле, затем промывают в течение 15 мин в фосфатном буфере или в 0,5 М растворе хлористого натрия на ТРИС-буфере (рН=7,6). Готовые препараты инкубируют в течение 10 мин в нормальной сыворотке кролика и 30 мин в растворе, содержащем фрагменты антител (анти-каппа или анти-лямбда), промывают и инкубируют с абсорбированной антисывороткой против антител, меченных пероксидазой. По окончании инкубации срезы вновь промывают в 0,5% растворе диаминобензидина, затем в 0,01% растворе перекиси водорода в фосфатном буфере или ТРИС-буфере. Оптимальное разведение сывороток определяют предварительным титрованием.
Непрямым иммунофлуоресцентным методом определяют лимфоциты различных субпопуляций, для чего нужны моноклональные антитела против поверхностных антигенов CD3, СD20, СD4 и СD8.
Метод мазков-отпечатков (модификация Изачик Н.А. с соавт., 1992).
При подготовке препаратов после извлечения зонда из эндоскопа биоптат стерильным пинцетом переносят на стерильные обезжиренные предметные стекла и делают мазки-отпечатки всех его поверхностей. После высушивания препараты фиксируют в абсолютном этиловом спирте, окрашивают по Романовскому-Гимза в течение 20–25 мин при комнатной температуре. При микроскопии под малым увеличением (х56) отмечают наличие слизи, нитей фибрина, скоплений эпителиальных клеток. Затем с использованием масляной иммерсии (х630) в препаратах, как правило по ходу слизистых тяжей, выявляют скопления кампилобактероподобных микроорганизмов, имеющих своеобразную извитую форму, напоминающую буквы «U»,»V»,»S». После обнаружения зоны максимального скопления бактерий проводят количественную оценку обсемененности слизистой оболочки полуколичественным способом. Так, обнаружение в препарате единичных хеликобактероподобных бактерий обозначают как «+», присутствие в поле зрения от 30 до 100 бактерий – «++», более 100 – «+++». Когда все поле зрения сплошь покрыто бактериями, дают оценку «++++».
Модификации быстрого уреазного теста
Используют «Де-нол тест» (фирма «Яманучи», Япония). Для его реализации биоптат слизистой оболочки из бранш щипцов перемещают в среду, реагирующую на присутствие мочевины, выделяемой НР. Присутствие бактерии в биоптате подтверждается изменением цвета среды через установленный промежуток времени. Чувствительность метода составляет 94%, а специфичность – 97%.
Можно использовать «Хелпилтест» (Государственный НИИ ХИМАНАЛИТ, С-Петербург, Россия), методика которого состоит в том, что биоптат слизистой оболочки помещается на диск из лакмусовой бумаги, реагирующей на присутствие мочевины, выделяемой НР. Согласно проведенным испытаниям чувствительность метода составляет 92%, а специфичность – 95%.
Микробиологические исследования.
Проводимые в соответствии с международными протоколами, они достаточно подробно описаны в специальной литературе, но, к сожалению, остаются недоступными подавляющему большинству лабораторий.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР).
Для проведения реакции используют коммерческие наборы НПО ЛИТЕХ (Россия).
В основе ПЦР лежит комплементарное достраивание ДНК-матрицы, осуществляемое in vitro с помощью фермента ДНК-полимеразы (репликация). Репликация включает несколько стадий: денатурацию ДНК, образование коротких двухцепочечных участков ДНК (затравок, необходимых для инициации синтеза ДНК), синтез новой цепи ДНК. Метод ПЦР представляет собой многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка ДНК.
Для проведения амплификации нужны 3 этапа, проходящих в разных температурных режимах:
– денатурация ДНК (расплетение двойной спирали) осуществляют при температуре 93–95С;
– отжиг (присодинение праймеров) – при 50–65С;
– комплементарное достраивание ДНК – при 72С.
Оценку результатов осуществляют методом электрофореза в агарозном геле. В качестве материала исследования берут сыворотку крови и кал.
Проведение ПЦР с использованием фекалий является весьма перспективным методом для педиатрической практики. Результаты оценивают как до, так и через 4–6 недель после лечения.
Helico blot
Тест предназначен для качественного выявления IgG к НР в сыворотке или плазме. Использование теста позволяет не только обнаружить НР, но и выявить антитела к специфическим белкам НР, включая такие, как CagA и VacA. Набор (например, «Helico blot 2.0» Genelabs Diagnostics-PTE Ltd., Singapore) полностью укомплектован реактивами и одноразовыми планшетами, необходимыми для исследования.
Проведение метода включает несколько этапов:
1. Используя пинцет, необходимо взять требуемое число стрипов из тубы и поместить пронумерованной стороной в каждую лунку планшета, включив стрипы для положительного и отрицательного контроля.
2. Добавить 2 мл разведенного промывающего раствора в каждую лунку.
3. Инкубировать стрипы около 5 минут при комнатной температуре на качающейся платформе, после чего удалить буфер отсосом.
4. В соответствующие лунки внести по 20 мкл образца или контрольной сыворотки, затем добавить по 2 мл специального буфера «для блоттинга».
5. Закрыть поднос крышкой и инкубировать 1 час при комнатной температуре на качающейся платформе.
6. Осторожно открыть поднос, избегая разбрызгивания или смешивания образцов, промыть каждый стрип 3 раза 2 мл разведенного промывающего буфера, вымачивая 5 минут на качающейся платформе между промывками и меняя наконечники при переходе от лунки к лунке.
7. Добавить 2 мл раствора, содержащего конъюгат (WORKING CONJUGATE SOLUTION), в каждую лунку. Закрыть поднос и инкубировать 1 час при комнатной температуре на качающейся платформе.
8. Удалить конъюгат. Промыть как на стадии 6.
9. Добавить 2 мл раствора, содержащего субстрат (WORKING SUBSTRATE SOLUTION), в каждую лунку. Закрыть поднос и инкубировать 15 мин на качающейся платформе.
10. Удалить раствор, содержащий субстрат, и прополоскать стрипы некоторое время в чистой воде для остановки реакции.
11. Используя пинцет, осторожно поместить стрипы на бумажное полотенце. Накрыть бумажным полотенцем и высушить.
12. Поместить стрипы на неадсорбирующую белую бумагу и оценить результаты в соответствии с прилагаемой шкалой.
Для получения точных результатов необходимо соблюдать следующие условия:
1. В отрицательном контроле не должны выявляться полосы, используемые для интерпретации. Возможно появление полос или широкая полоса в области 60 кD, но реактивность с этими полосами неспецифична для НР.
2. В положительном контроле должны проявляться все относящиеся к НР полосы с соответствующим молекулярным весом. Этой тест-системой визуализируются полосы соответственно 116 kD, 89 kD, 35 kD, 30 kD, 26,5 kD, 19,5 kD.
3. Контрольная (сверочная) полоса должна быть представлена на всех стрипах. Присутствие этой полосы на стрипе и отсутствие дополнительных полос должно показывать, что не добавлялось тестируемых сывороток или конъюгатов и нет других технических погрешностей.
4. Каждый стрип с образцом необходимо сравнивать со стрипами, использованными в данном исследовании для отрицательного и положительного контроля. В результате можно четко локализовать и идентифицировать полосы на «рабочих» стрипах.
Рекомендуется считать результат положительным, если имеется одна полоса в области 116 kD, 89 kD, 35 kD или две полосы в областях 30 kD, 26,5 kD, 19,5 kD. Больные, инфицированные НР, имеют несколько указанных выше полос. При отсутствии реакции с этими полосами или аномальной реакции результаты интерпритируются как отрицательные. Больные, имеющие антитела к белкам CagA (116 kD) и VacA (89 kD), инфицированы наиболее патогенными штаммами НР.
В нашей стране для массового первичного скрининга детей нашли применение и другие малоинвазивные и неинвазивные методы диагностики.
ХЕЛИК-тест с меченой мочевиной разработан по аналогии с дыхательными углеродными тестами (Государственный НИИ ХИМАНАЛИТ, Ст.-Петербург, Россия). В основе исследования лежит оценка прироста концентрации аммиака в воздухе полости рта после приема пациентом мочевины нормального изотопного состава 12С 1H4 14N2 16О. При наличии в желудке НР, мочевина разлагается уреазой, вызывая усиленное образование аммиака и нарастание его концентрации в выдыхаемом воздухе, что фиксируется с помощью индикаторных трубок.
Перед началом исследования у ребенка натощак измеряется фоновая концентрация аммиака в воздухе полости рта. Для этого через стеклянную индикаторную трубку, заполненную селективным хемосорбентом, с помощью аспиратора прокачивается 2 л воздуха из ротовой полости пациента. Затем обследуемый принимает 500 мг мочевины в 15–20 мл дистиллированной воды, далее каждые 2 мин в течение последующих 10 мин оценивают концентрацию аммиака в воздухе полости рта. Оценка проводится по нарастанию длины окрашенного столбика в индикаторной трубке после приема мочевины. Один мм длины столбика соответствует 0,3 мг/ммоль аммиака. При этом проведенные исследования показали, что об уреазной активности НР позволяет судить лишь динамическая оценка концентрации аммиака в выдыхаемом воздухе. Результаты теста не зависят от особенностей азотистого обмена пациента. Чувствительность ХЕЛИК-теста составляет 97%, специфичность – 96%.
Экспресс-диагностика пилорического хеликобактериоза по присутствию специфических антител класса IgG к НР проводится в специальных планшетах фирмы «Kvidel» (США). При постановке метода 1 мл капиллярной крови вносят в специальную лунку, из которой субстрат распространяется по бумажному сорбенту ко второму «окошку» в крышке планшета. Появление в «окошке» коричневой полосы является признаком достоверности реакции, а появление второй полосы – признаком присутствия специфических антител класса IgG к HР. По данным разработчиков и специалистов, проводивших сравнительные испытания, чувствительность метода составила 89%, специфичность – 96%.
Экспресс-метод FastRead H.pylori(CQI Medical Products Inc, Singaporе)аналогичен описанному выше эспресс-методу визуального обнаружения специфических антител класса IgG к HР. По результатам мультицентрового исследования специфичность метода составляет 100%, чувствительность 91%.
Экспресс-тест QuikStrip OneStep H.Pylori Test(фирма «Биомедрепродукция», Россия) – быстрый одноэтапный иммунохимический диагностикум для качественного (полуколичественного) определения в исследуемых образцах сыворотки, плазмы или цельной крови антител к HP, предназначен для диагностики НР-инфекции. QuikStrip OneStep H.Pylori Test основан на принципе иммунохроматографического выявления всех изотипов антител (IgG, IgМ, IgА) против пилорического хеликобактера. В стрип-тесте используются поликлональные и моноклональные антитела. Первое антитело иммобилизированно на пористой мембране, второе связано с частицами коллоидного золота (используемого в качестве сигнализирующего маркера). Образцы, взятые у пациентов, обрабатывают специальным реагентом – буфером для экстракции, после чего стрип-тест полоску опускают в чашку-пробирку, содержащую смесь образца и экстрагирующего буфера. Смесь мигрирует по мембране стрип-тест полоски. Комплекс антитело – антиген – коньюгат (антитело, связанное с маркером-коллоидным золотом) образуется при наличии антител к НР в образце, что проявляется в виде двух розовых полосок на мембране стрип-теста (позитивный результат). При отсутствии антител к РН в исследуемом образце проявляется только одна розовая полоска на мембране стрип-теста – негативный результат.
Перед проведением анализа компоненты диагностикума согревают до комнатной температуры, помечают пластиковые пробирки по числу анализируемых образцов и устанавливают их в штатив. После этого в каждую пробирку помещают по 1 капле образца, добавляют 9 капель буфера для экстракции и тщательно перемешивают. Стрип-полоску устанавливают вертикально в пластиковую пробирку с сывороткой. Результат оценивают через 10 минут.
Определение вязкости желудочной слизи.
Относительную вязкость желудочного сока, содержащего слизь, определяют, используя вискозиметр Оствальда. До начала исследования центрифугируют желудочный сок, нейтрализованный до рН=7,0 при 400 g в течение 40 мин. На первом этапе оценивают вязкость 5 мл дистиллированной воды (контрольная жидкость), а затем такого же количества супернатанта желудочного сока. Результат выражают в единицах относительной вязкости, используя формулу:
,
где
N – относительная вязкость,
T1– время истечения супернатанта желудочного сока,
Т0– время истечения контрольной жидкости.
Определение вязкости желудочного сока позволяет уточнить состояние защитных свойств слизистой оболочки желудка
В соответствии с Приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации от 03.08.1999 года № 303 введен в действие Отраслевой Стандарт: «Протоколы ведения больных. Общие положения. 91500.09.0001-1999». Стандарт является базой нормативных документов по стандартизации системы здравоохранения Российской Федерации.
Отраслевой стандарт предполагает следующие критерии оценки методов диагностики:
чувствительность – частота положительных результатов при наличии заболевания;
специфичность – частота отрицательного результата при отсутствии заболевания;
прогностическая ценность – вероятность заболеваний при положительном результате и вероятность отсутствия – при отрицательном;
отношение правдоподобия – отношение вероятности данного результата у лиц с заболеванием к вероятности данного результата у лиц без заболевания;
безопасность метода – суммарная частота побочных эффектов и осложнений при применении данного метода диагностики;
степень доступности – отношение числа граждан страны, которые могут получить своевременно данную услугу с учетом территориальных особенностей регионов и разобщенности медицинских учреждений, наличия соответствующего оборудования и специалистов к числу граждан, не могущих своевременно получить такую услугу;
стоимость метода исследования с учетом капитальных затрат, текущих прямых расходов и косвенных расходов;
соотношение стоимость/эффективность – ориентировочные расчеты по стоимостной целесообразности использования того или иного метода диагностики при данном заболевании.
Результаты многоцентровых исследований показывают диагностическую ценность таких методов диагностики НР, как иммуноблоттинг (Helico blot 2.0) и ПЦР, применение которых позволяет не применять биопсию с морфологическим исследованием биоптатов. Для метода обнаружения IgG антител к Нelicobacter pylori «Helico blot 2.0» показатели по результатам проведенной работы выглядят следующим образом: чувствительность, специфичность, прогностическая ценность, безопасность метода, отношение правдоподобия – 100%. Степень доступности – недостаточна, так как его использование возможно только в оснащенных лабораториях областных, краевых и крупных городских и ведомственных больниц. Стоимость метода в настоящее время делает его недоступным для значительного числа лечебных учреждений. Что касается соотношения стоимость/эффективность, то достаточно высокая стоимость даже при высочайшей эффективности ограничивает применение метода.
Наиболее перспективной является диагностика, основанная на ПЦР биоптата.Оборудованием для ее проведения оснащены многие лаборатории крупных и средних больниц и диагностических центров. Положительной стороной метода является возможность использования его для контроля лечения, а отрицательной – инвазивность метода. Освободиться от отрицательных свойств позволяет использование в качестве субстрата для исследования кала больного ребенка. Широкое внедрение этого метода выводит диагнотику НР-ассоциированной патологии на новый уровень, при котором для определения результатов лечения и контроля состояния пациентов будет использоваться современный, недорогой, абсолютно неинвазивный высокоэффективный метод. В свою очередь возможным становится проведение под контролем ПЦР полноценных профилактических мероприятий.
Для экспресс-методов визуального обнаружения антител к НР («FastRead», QuikStripOneStepHPTest)отмечается максимальная (до 100%) степень безопасности пациента, высокая чувствительность и специфичность. Достаточно высокая прогностическая ценность при положительном результате сочетается у этих методов с недостаточно высокой прогностической ценностью при отрицательном результате. Подобное положение сохраняется и для такого показателя, как «отношение правдоподобия». Степень доступности этих методов высока, так как любой ребенок может быть обследован независимо от места жительства; стоимость же этой группы методов в настоящее время делает их малодоступными для всех лечебных учреждений. Соотношение стоимость/эффективность заставляет сделать вывод, что методы имеют достаточную эффективность и могут использоваться для скрининга, а в отдельных случаях и для диагностики. Перспективным, с точки зрения внедрения в клиническую практику, представляется снижение стоимости методов, что будет способствовать широкому их распространению.
Группа «уреазных методов» («Де-нол тест» и «Хелпилтест»)демонстрирует недостаточную степень безопасности для обследуемых из-за инвазивности, высокую чувствительность и специфичность, прогностическую ценность и отношение правдоподобия. Степень доступности этих методов невысока, так как «Де-нол тест» в Россию поступает в ограниченных количествах, а Хелпилтест не распространен из-за малых объемов производства. Низкая стоимость делает возможным распространение этих методов, но перспективность ограничена их инвазивностью – привязке к эзофагогастродуоденоскопии и необходимости получения биоптатов.
Незаслуженно забыт метод мазков-отпечатков,имевший ранее широчайшее распространение, полностью подтверждавший звание «Золотого стандарта» для гистологического исследования. Однако необходимость биопсии слизистой оболочки желудка делает его малопривлекательным для педиатрической практики, особенно при возможности использования неинвазивных методов.
Бактериологическое исследование доступно в высокооснащенных лабораториях крупнейших научных центров и клиник, а дыхательный тест с изотопом углерода из-за высокой стоимости оборудования используют лишь несколько лечебных учреждений страны.
Для скрининговых обследований за счет удовлетворительных показателей чувствительности, специфичности и невысокой стоимости возможно расширение применения в педиатрии разработанного отечественными учеными дыхательного Хелик-теста.