Экспрессия генов Патрушев

571

Хромосомы высших организмов содержат в своем составе протяженные молекулы ДНК. Например, длина ДНК одной из типичных хромосом человека составляет 100–200 миллионов пар оснований (м.п.о.). Исследование генов в хромосомах высших растений, животных и человека потребовало создания векторов для клонирования фрагментов ДНК длиной в несколько сотен тысяч пар оснований. Этим задачам отвечает недавно созданная система для клонирования сверхдлинных молекул ДНК на основе искусственно полученной мини-хромосомы дрожжей YAC (yeast artificial chromosome). YAC-вектор представляет собой кольцевую молекулу ДНК, содержащую ряд генетических элементов, которые позволяют ей существовать во внехромосомном состоянии в клетках дрожжей (рис. II.9).

Вектор заключает в себе две теломерные последовательности нуклеотидов TEL, необходимые для репликации концов мини-хромосомы, и область начала репликации ARS1, соединенную с последовательностью центромеры. Все эти функциональные элементы требуются для репликации YAC-вектора и его правильной передачи в дочерние ядра во время митоза. Кроме того, вектор содержит два селектируемых маркера TRP, восстанавливающих способность к росту ауксотрофных по триптофану клеток дрожжей в отсутствие экзогенного триптофана, а также маркер URA3, компенсирующий генетический дефект клеток дрожжей, который нарушает биосинтез урацила. В векторе имеется также ген супрессорной тРНК sup4, являющийся селектируемым маркером для поддержания вектора в мутантных бактериальных клетках, содержащих амбер-мутации в жизненно важных генах. Помимо этого, он обладает последовательностями нуклеотидов, необходимыми для его репликации в бактериальных клетках.

При подготовке к клонированию YAC-вектор, выделенный в виде плазмиды, расщепляют рестриктазой BamHI и отделяют от образовавшегося короткого фрагмента ДНК, который не требуется для репликации YAC-вектора в дрожжах (этап 1). После этого проводят второе расщепление вектора рестриктазой EcoRI, сопровождающееся образованием двух его "плеч", каждое из которых на одном из концов содержит теломерные последовательности хромосомы дрожжей (этап 2). На заключительном этапе (3) полученные "плечи" лигируют с крупными EcoRI-фрагментами клонируемой ДНК, которые получают путем частичного расщепления высокомолекулярной хромосомной ДНК,

572

предназначенной для клонирования. Полученными таким образом рекомбинантными ДНК трансформируют протопласты клеток дрожжей, и образовавшиеся трансформанты отбирают на селективной твердой питательной среде. В таком векторе удавалось осуществлять клонирование фрагментов ДНК длиной до 700 т.п.о.

При всех своих достоинствах системы клонирования, основанные на векторах семейства YAC, обладают рядом существенных недостатков. В рекомбинантных ДНК, поддерживаемых в таких системах, часто возникают внутренние делеции. Кроме того, при введении рекомбинантных ДНК в клетки дрожжей иногда имеет место проникновение в одну клетку нескольких молекул вектора со вставками. В итоге отдельные клоны дрожжевых клеток могут содержать несколько несцепленных друг с другом молекул рекомбинантных ДНК, а рекомбинация между ними вообще может приводить к образованию химерных молекул. Все это очень затрудняет физическое картирование генов в хромосомах исследуемых объектов. Для преодоления такого рода трудностей были сконструированы альтернативные векторные системы, среди которых наиболее популярными в настоящее время являются системы, основанные на

искусственных хромосомах бактерий – BAC (bacterial artificial chromosome).

Рис. II.10. Вектор pBAC108L – представитель семейства BAC-векторов

573

В векторных системах BAC используется ДНК хорошо изученного полового фактора (F-фактора) E. coli – гигантской плазмиды мужских бактериальных клеток, которые являются донорами бактериальной ДНК при конъюгации с женскими клетками (рис. II.10). Типичный F-фактор содержит гены oriS, repE, parA и parB, регулирующие его собственную репликацию и контролирующие число его копий в бактериальных клетках. В частности, гены oriS и repE обеспечивают однонаправленную репликацию F-фактора, а гены parA и parB поддерживают число его копий на уровне одной-двух на бактериальную клетку. Классический вектор BAC (pBAC108L) включает в себя все эти гены, а также ген устойчивости к хлорамфениколу, используемый в качестве селектируемого маркера. Вектор содержит также сегмент ДНК, по которому производится клонирование. В этом сегменте имеется типичный полилинкер, а также два уникальных сайта рестрикции HindIII и BamHI, фланкированные промоторами T7- и Sp6-РНК-полимераз. Эти промоторы могут быть использованы для получения РНК-зондов, необходимых для осуществления "прогулок по хромосомам" (раздел 7.6.2), а также прямого секвенирования клонированной ДНК в месте стыковки с вектором. Кроме того, во фрагменте имеется сайт cosN, обеспечивающий расщепление вектора со вставкой в уникальном месте с помощью терминазы фага λ без применения ферментов рестрикции. Этот фермент используется бактериофагом для специфического разрезания конкатемеров своей хромосомы при упаковке в фаговые частицы. Для той же цели может быть применен и сайт loxP бактериофага Р1, который является мишенью для фаговой эндонуклеазы Cre. Эти сайты используются для получения специфических концов клонированной ДНК с целью ее дальнейшего рестрикционного картирования путем введения концевой метки с последующим неполным расщеплением с помощью рестриктаз и электрофоретическим разделением образовавшихся фрагментов

(см. раздел 7.6.1).

Современные BAC-векторы позволяют клонировать фрагменты ДНК длиной до 300 т.п.о. и выше. Рекомбинантные молекулы вводятся в клетки E. coli с помощью электропорации (см. раздел 7.3.2), причем эффективность образования трансформантов в 10–100 раз выше, чем при обычной трансформации сферопластов дрожжей векторами семейства YAC. Это позволяет уменьшить исходное количество ДНК, необходимое для

574

конструирования репрезентативных клонотек генов (см. раздел 7.3). При скрининге таких клонотек используются традиционные методы работы с бактериальными колониями (раздел 7.3.3). В отличие от YAC-ДНК, которая находится в клетках дрожжей в линейной форме, BAC-векторы со вставками, как и традиционные F’-факторы, существуют в бактериальных клетках в виде кольцевых суперскрученных молекул. Это облегчает их выделение и последующую работу с рекомбинантными молекулами ДНК в растворе, а кроме того, допускает простое повторное введение в бактериальные клетки этих ДНК, выделенных минипрепаративными методами. Поскольку рекомбинантные BACвекторы существуют в бактериальных клетках в виде одной копии, исключаются совместное клонирование в одной клетке разных фрагментов ДНК и образование химерных молекул, что весьма существенно для физического картирования больших геномов методами "снизу вверх" (см. раздел 12.1.4). Весьма существенным свойством системы клонирования, основанной на векторах семейства BAC, является ее генетическая стабильность. Исходная структура клонированных фрагментов ДНК в пределах точности использованных методов сохраняется в таких векторах даже после 100 серийных пересевов бактериальных клеток, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК. Все вышеперечисленные свойства переводят векторы BAC в разряд сверхъемких векторов нового поколения.

В заключение следует упомянуть о семействе векторов PAC (P1-derived artificial chromosome), также часто используемых в современных исследованиях. Векторы этой серии содержат гены бактериофага Р1, обеспечивающие репликацию фаговой хромосомы в зараженных бактериальных клетках. Рекомбинантные ДНК на их основе (размер вставки 150–200 т.п.о.) также вводятся в бактериальные клетки с помощью электропорации.

7.2.5. Интегрирующие и челночные (бинарные) векторы

Векторы, пригодные для клонирования ДНК в бактериях, отличающихся от E. coli, должны обладать всеми характерными чертами, которые были отмечены выше. От только что рассмотренных они отличаются главным образом тем, что содержат природные или искусственные генетические элементы, функционирующие в новых клетках-хозяевах.

575

Интегрирующие векторы грамположительной бактерии Bacillus subtilis. B. subtilis, как и E. coli, является излюбленным объектом генной инженерии. Это связано с тем, что B. subtilis – непатогенный микроорганизм, многие штаммы которого широко используются в микробиологической промышленности для производства биологически активных соединений и пищевых веществ. В отличие от E. coli B. subtilis способна секретировать белки и пептиды, что облегчает их очистку и дальнейшее использование. Большинство векторов для клонирования ДНК в клетках B. subtilis создано на основе плазмид других видов бацилл, а также Staphylococcus aureus и бактерий рода Streptococcus.

Рис. II.11. Челночный вектор pFH7 (а) и экспрессирующий вектор pPR- TGATG-1 (б)

Обозначено расположение генов и уникальных сайтов рестрикции

Основным свойством интегрирующих векторов является их способность стабильно встраиваться в геном клетки-хозяина. Это становится возможным благодаря наличию в таких векторах последовательностей нуклеотидов, гомологичных последовательностям геномной ДНК. В результате функционирования общей системы рекомбинации происходит объединение хромосомной и плазмидной ДНК интегрирующего вектора, которое приводит к стабильному включению всей векторной плазмиды в хромосому. Примером

576

такого интегрирующего вектора служит плазмида pFH7 B. subtilis (рис. II.11,а). Векторная плазмида содержит фрагмент ДНК умеренного бактериофага SPβ и после попадания в клетки B. subtilis, лизогенные по данному бактериофагу, эффективно интегрируется в профаг. Поскольку плазмида содержит ген устойчивости к хлорамфениколу cat, клетки приобретают этот признак. Индукция профага приводит к образованию фаговых частиц, трансдуцирующих такую плазмиду и ассоциированный с ней признак устойчивости к хлорамфениколу. Интеграция плазмиды SPβ в бактериальную хромосому происходит по механизму гомологичной рекомбинации с участием гена recE.

Способность к интеграции в бактериальную хромосому обнаруживают и другие плазмиды, содержащие фрагменты хромосомной ДНК клеток-хозяев, что продемонстрировано, в частности, для плазмид E. coli и Streptococcus pneumoniae.

Интегрирующие векторные системы, в которых используется тот же принцип гомологичной рекомбинации, разработаны и для эукариотических клеток, включая клетки животных и растений. В конце концов, такие работы привели к развитию целого направления исследований по созданию трансгенных животных и растений, стабильно наследующих и экспрессирующих гены, искусственно введенные в их геном. О некоторых важных следствиях этого направления исследований, включая генотерапию, речь пойдет в главе

10.

Наличие феномена гомологичной рекомбинации между хромосомной ДНК клетки-хозяина и векторной ДНК, содержащей гомологичные хромосомной ДНК последовательности нуклеотидов, приходится учитывать при получении соответствующих генно-инженерных конструкций. Такая неконтролируемая рекомбинация в большинстве случаев нежелательна, так как может приводить к потере или структурным перестройкам клонированных фрагментов ДНК. Для того чтобы свести последствия этого явления к минимуму, используют специальные штаммы клеток-хозяев, в которых общая система рекомбинации не функционирует, например вследствие мутационной инактивации гена recA

E. coli или recE B. subtilis.

Челночные векторы. Интегрирующая плазмида pFH7 (см. рис. II.11,а) дает возможность проиллюстрировать еще один важный принцип, широко используемый при конструировании векторных систем в генной инженерии. Эта

577

плазмида получена путем объединения двух репликонов, один из которых берет начало от плазмиды pC194 B. subtilis, а другой – от плазмиды pBR322 E. coli, что дает возможность вектору существовать и стабильно реплицироваться как в клетках E. coli, так и B. subtilis. Такие векторы, способные реплицироваться в клетках-хозяевах разных биологических видов, называют челночными, или бинарными векторами.

Принципы конструирования и функционирования челночных векторов одинаковы, они должны включать в себя репликоны тех генетических систем, в которых будет происходить репликация челночного вектора. При этом используются области начала репликации генетических элементов, которые автономно существуют во внехромосомном состоянии в природных условиях. Так, обсуждавшийся выше интегрирующий вектор pFH7 B. subtilis обладает свойствами челночного вектора, поскольку для его конструирования использованы репликоны двух видов бактерий. Более эффектными примерами челночных векторов являются плазмидные ДНК, способные реплицироваться в клетках высших (животных и растений) и низших организмов. Необходимость использования челночных векторов в генной инженерии связана с тем, что наработку в препаративном количестве векторной ДНК для проведения генноинженерных манипуляций удобнее проводить в бактериальных клетках, тогда как получение биологически активных продуктов клонированных генов высших организмов во многих случаях возможно только в клетках своего или близкого вида, в которых эти гены экспрессируются в природных условиях, т.е. в своем обычном генетическом окружении (подробнее см. раздел 7.6).

7.2.6. Конструирование экспрессирующих векторов и их функционирование

Первая часть книги была посвящена описанию механизмов, обеспечивающих высокоэффективную и высокоспецифическую экспрессию генов. Такого рода информацию успешно используют в настоящее время для эффективной экспрессии рекомбинантных генов в гомологичном или гетерологичном генетическом окружении. После рассмотрения основных принципов конструирования векторов для клонирования ДНК можно перейти к обсуждению проблемы экспрессии клонированных генов в искусственных генетических системах. Именно экспрессия клонированных генов является одной из основных задач генной инженерии. Действительно, функциональную

578

роль отдельных генов и их частей в живом организме можно понять и оценить лишь по их экспрессии, т.е. по фенотипическому проявлению их потенциальных биологических возможностей. Для получения полноценной экспрессии клонированных генов используют экспрессирующие векторные системы, принципы конструирования которых в настоящее время хорошо разработаны.

Напомним, что экспрессия генетической информации, заключенной в генах живых организмов, в соответствии с основным постулатом молекулярной биологии осуществляется путем ее переноса от нуклеиновых кислот к белкам по схеме: ДНК ↔ РНК → белок. Любой полноценный в функциональном отношении ген, в том числе и рекомбинантный, состоит из двух основных частей – регуляторной и структурной. Генетический код, с помощью которого последовательность нуклеотидов в кодирующей структурной части гена определяет последовательность аминокислот в кодируемом этим геном белке, за немногими исключениями, универсален для всех живых организмов. Это дает принципиальную возможность получения полноценной экспрессии самых разнообразных осмысленных последовательностей нуклеотидов, в том числе и искусственно синтезированных, в любом природном генетическом окружении. Таким образом, универсальность генетического кода является прочной основой для создания функционально активных генно-инженерных конструкций.

Регуляторная часть генов распознается соответствующими ферментными системами организма и обеспечивает упорядоченную экспрессию его структурной части. При этом регуляторная часть гена, как правило, высокоспецифична в отношении своих природных генетических эффекторов (РНК-полимераз, рибосом, факторов транскрипции и трансляции, белковых факторов сплайсинга, ферментов, осуществляющих посттрансляционные модификации полипептидов, и т.п.), и чаще всего она не может эффективно функционировать в гетерологичном генетическом окружении. Очевидно, что при конструировании высокоэффективных экспрессирующих векторов необходимо, прежде всего, учитывать особенности структуры регуляторной части рекомбинантного гена, исходя из того, в каких генетических условиях клонированный ген предполагается экспрессировать. Однако не только регуляторные последовательности генов являются препятствием для высокоэффективной экспрессии чужеродных рекомбинантных генов. Структурные части генов про- и эукариот

579

фундаментально отличаются друг от друга по наличию у последних внутри генов многочисленных и протяженных некодирующих последовательностей нуклеотидов – интронов. Следовательно, гены эукариот не могут эффективно экспрессироваться в клетках прокариот, поскольку у прокариот отсутствуют соответствующие системы сплайсинга. Кроме того, у предшественников эукариотических мРНК не может осуществиться в бактериальных клетках и правильный процессинг 3’- и 5’-концевых некодирующих последовательностей. Даже такой беглый взгляд на проблему экспрессии рекомбинантных генов в чужеродном генетическом окружении позволяет увидеть многочисленные препятствия, лежащие на пути решения этой проблемы. Ниже будут рассмотрены факторы, которые необходимо учитывать при конструировании экспрессирующих векторов.

Факторы, оказывающие влияние на эффективность экспрессии рекомбинантных генов: транскрипция. Для того чтобы в клетках E. coli или любого другого организма произошла экспрессия клонированного гена, этот ген должен быть транскрибирован РНК-полимеразой, а образовавшаяся РНК транслирована рибосомами с образованием нативного белкового продукта. Следовательно, для эффективной экспрессии в клетках E. coli любой ген должен находиться под контролем регуляторных элементов данного микроорганизма. Особенности структуры и функционирования регуляторных элементов генов про- и эукариот были подробно рассмотрены в первой части книги. Знание основных принципов строения и функционирования промоторов позволяет конструировать новые промоторы, которые по своей эффективности могут превосходить природные. Примером такого промотора, используемого в некоторых экспрессирующих векторах, является промотор Taq, который в своем составе объединяет последовательности промоторов лактозного и триптофанового оперонов E. coli.

Базальный уровень транскрипции рекомбинантных генов гарантируется небольшим набором упорядоченных регуляторных последовательностей. Например, у E. coli это происходит при наличии перед структурной частью клонированного гена последовательностей в окрестностях нуклеотидов +1, -10

и –35.

580

Однако даже у E. coli транскрипция большинства генов носит регулируемый характер, что обеспечивается системой белков-репрессоров и активаторов, а также низкомолекулярных эффекторов, которые главным образом влияют на взаимодействие РНК-полимеразы с транскрибируемыми генами. Необходимость регулирования экспрессии генов в генной инженерии диктуется, прежде всего, тем, что сверхэкспрессия клонированных генов в клеткахпродуцентах рекомбинантных белков при использовании сильных конститутивных промоторов может отрицательно сказываться на их жизнеспособности, поскольку промежуточные и конечные продукты экспрессии часто обладают цитотоксическим действием. В этом случае сверхэкспрессия клонированных генов сопровождается снижением скорости или даже полной остановкой роста бактериальных или иных клеток. Для предотвращения такого рода эффектов в генной инженерии и биотехнологии используют генноинженерные конструкции, в которых экспрессия клонированных генов в значительной степени подавлена (репрессирована) на ранних фазах роста культуры рекомбинантных клеток и может быть дерепрессирована в любой нужный момент времени.

В качестве примера рассмотрим две системы регулируемой экспрессии рекомбинантных генов в клетках E. coli, которые получили широкое распространение. В одном случае для контроля экспрессии клонированных генов используют хорошо изученную систему регуляторных элементов лактозного оперона, в другом – систему промотор–репрессор–оператор фага λ. Принцип регуляции экспрессии рекомбинантных генов в обоих случаях один и тот же. В векторные молекулы вводятся регуляторные последовательности фага λ или lac-оперона, за которыми следуют последовательности нуклеотидов полилинкера с несколькими уникальными сайтами рестрикции, по которым проводится клонирование исследуемого гена. Одновременно в тот же вектор вводится ген-регулятор, кодирующий белок-репрессор. В отсутствие индуцирующего воздействия молекулы репрессора, ген которого экспрессируется конститутивно, связываются с оператором, тем самым препятствуя взаимодействию РНК-полимеразы с промотором, под контролем которого находится клонированный рекомбинантный ген. Это приводит к