Глава 2. Эксперимент по обучению клеток культуры гиппокампа

2.1 Компоненты экспериментальной установки

Для проведения эксперимента по обучению используются следующие оборудование и программное обеспечение:

1) Культура нейронов гиппокампа, выращенная на мультиэлектродной матрице системы MED64. Используется культура на 20-й или более поздний день развития и должна обладать спонтанной регулярной пачечной активностью.

2) Система MED64.

3) Стимулятор MultiChannel Systems STG 4004 и прилагаемое программное обеспечение.

4) Компьютер для управления регистрацией и стимуляцией культуры.

5) Плата АЦП/ЦАП National Instruments PCI-6221.

6) Программа NLearn.

2.2 Подготовка экспериментальной установки

1) Установить зонд с культурой клеток в соединяющее устройство (коннектор), подключенному к усилителю системы MED64 (MED64 Amplifier).

2) Проверить подключение всех кабельных соединений: соединения выхода стимулятора STG 4004 с входом "EXT STIM 1" на усилителе MED64, выбор стимулируемого электрода на передней панели усилителя MED64, соединения выхода с используемого электрода на усилителе MED64 с аналоговым входом "AI1" АЦП, подключенного к компьютеру регистрации-стимуляции.

3) В соответствующие гнезда на передней панели усилителя MED64 вставить штекер от внешнего стимулятора STG 4004 для подачи сигнала.

4) Включить усилитель MED64, компьютер MED64, компьютер, управляющий регистрацией/стимуляцией и внешний стимулятор STG 4004.

5) Произвести калибровку усилителя MED64 с помощью программы MED Conductor.

6) Запустить на компьютере управления стимуляцией-регистрацией программу NLearn.

2.3 Методика регистрации сигналов с использованием мультиэлектродной матрицы

После подготовки установки управление экспериментом осуществляется с помощью программы NLearn. Данная программа осуществляет регистрацию сигналов с одного электрода мультиэлектродной матрицы, детектирование импульсов, автоматическое управление стимуляцией и анализ вызванных ответов на стимул.

Сигнал, полученный с электрода, программно пропускается через низкочастотный фильтр. Частота, выше которой сигнал поступает на дальнейший анализ, устанавливается в поле "Filter frequency". Затем устанавливается коэффициент чувствительности порога детектирования импульсов "Sigma threshold" в диапазоне от 4 до 8 так, чтобы на графике детектированных импульсов не отображались фоновые межпачечные импульсы. Порог детектирования в милливольтах отображается в поле "Threshold Value" (Рис. 2.1).

Рисунок 2.1. Программа Nlearn с основными элементами управления параметрами регистрации импульсов

2.4 Стимуляция культуры нейронов

Для проведения эксперимента по обучению нейронов на мультиэлектродной матрице необходимо убедиться, что стимуляция выбранной пары электродов вызывает пачку активности в сети клеток. Кнопка включения/выключения стимуляции "Stimulation ON/OFF" запускает генерацию последовательности импульсов напряжения на аналоговом выходе ЦАП с частотой, заданной в поле "Stimulation frequency (Hz)" на вкладке "Stimulation". Каждый импульс длительностью 400 мс и напряжением 5 В на выходе ЦАП запускает генерацию импульса напряжения на стимуляторе STG 4004. Импульс далее проходит через выбранную пару электродов, деполяризуя клетки, находящиеся вблизи.

Стимуляция продолжается в течение двух минут. Для эксперимента выбирается только электроды, стимуляция которых способна вызывать пачки импульсов на более чем 50% стимулов. Далее выбирается интервал времени после стимула, в котором регистрируется количество вызванных импульсов (динамическая характеристика ответа). Данный интервал выбирается таким, чтобы отношение суммарного количества ответов на количество стимулов (R/S) при стимуляции была < 0,1. Чаще всего интервал равен 40-80 мс.

На вкладке "Stimulation" кнопка "Trail stimulation ON/OFF" включает циклы стимуляции с заданными параметрами: длительность стимуляции указывается в поле "Seconds to stim", длительность перерывов – в поле "seconds to rest". По умолчанию период непрерывной стимуляции установлен длительностью 600 секунд и перерыв между стимуляцией - 300 секунд (Рис. 2.2).

Рисунок 2.2 Блок управления параметрами стимуляции