Глава 3. Методы выделения, очистки и количественного определения белков

Особенности строения и функционирования организма зависят от набора белков, синтезирующихся в нем. Изучение строения и свойств белков невозможно без их выделения из клетки и очистки от других белков и органических молекул. Нижеописанные методы ориентированы, в первую очередь, на выделение и очистку ферментов.

3.1. Физико-химические свойства белков

Индивидуальные белки различаются по физико-химическим свойствам:

• молекулярной массе (набору аминокислот, первичной структуре);

• форме молекул (третичной структуре);

• суммарному заряду, величина которого зависит от соотношения анионных и катионных групп аминокислот;

• соотношению полярных и неполярных радикалов аминокислот;

• степени устойчивости к воздействию различных денатурирующих агентов.

Растворы белков являются молекулярно-дисперсными, или истинными, растворами (размеры частиц – 0,10,001 мкм), однако вследствие большого размера растворенных молекул такие растворы имеют некоторые свойства, общие с коллоидными растворами (гидрофобные и гидрофильные свойства, осмотическое давление, вязкость, способность к диффузии, седиментация и др.).

Белки являются амфотерными соединениями и в водных растворах заряжены. Распределение заряженных остатков на поверхности белковой молекулы при определенном значении рН обусловливает ее суммарный заряд. Величина заряда белков – один из факторов, увеличивающих их растворимость. При изменении рН белкового раствора меняется степень диссоциации функциональных групп боковых цепей аминокислот, что приводит к изменению суммарного заряда молекулы и, как следствие, растворимости белка.

В кислой среде увеличение концентрации Н⁺ ведет к подавлению диссоциации карбоксильных групп (–СОО^ + Н⁺  –СООН) и уменьшает отрицательный заряд белка. В щелочной среде связывание избытка ОН^ с протонами, образующимися при диссоциации аминогрупп (NH₃⁺ + ОН^  –NH₂ + Н₂О) с образованием воды, приводит к уменьшению положительного заряда белка. При потере заряда в изоэлектрической точке белки легче агрегируют и выпадают в осадок.

Распределение гидрофильных и гидрофобных остатков аминокислот на поверхности белковой молекулы также является признаком, определяющим растворимость белка в различных растворителях. Растворение белков в воде связано с образованием вокруг белковой глобулы водных (гидратных) оболочек, состоящих из ориентированных молекул воды. Гидрофобные группы хотя и стремятся сконцентрироваться внутри белковой молекулы, но значительная их часть располагается на поверхности и контактирует с растворителем. Гидрофобным группам на поверхности белковых молекул наряду с заряженными и другими полярными группами принадлежит важная роль в определении поведения белков.

Основным компонентом растворителей белков обычно является вода, поэтому для изменения растворимости белка можно манипулировать свойствами воды как растворителя, изменяя ионную силу, рН, количество добавляемых, смешивающихся с водой, органических растворителей и других веществ, а также комбинируя эти изменения с изменением температуры.

Таким образом, растворимость белков зависит как от вышеперечисленных физико-химических свойств белков, так и от состава и свойств среды, в которой растворяется белок.