2. Качественный анализ полисахаридов
При взаимодействии крахмала и гликогена с йодом образуются комплексные соединения, окрашенные в темно-синий и красно-бурый цвета соответственно. Эти различия обусловлены отличиями в химической структуре полисахаридов. Темно-синее окрашивание комплекса йод крахмал обусловлено -амилозой, хотя содержание амилопектина в зернах крахмала в несколько раз превышает количество -амилозы. Тем не менее темно-синее окрашивание, возникающее при действии йода на -амилозу, перекрывает красно-фиолетовую окраску комплекса йод амилопектин.
Окраска продуктов реакций крахмала и гликогена с йодом исчезает при нагревании или добавлении NaOH (KOH) и появляется при охлаждении реакционной смеси. Это свидетельствует об образовании нестойких адсорбционных комплексов крахмала и гликогена с йодом и обусловлено тем, что в их образовании принимает участие молекулярный йод, а не иодид-ионы.
В пробирки с 0,5 мл дистиллированной воды вносят небольшое количество (на кончике шпателя) порошка выделенных крахмала и гликогена. Пробирку с крахмалом нагревают на кипящей водяной бане до растворения крахмала, а затем содержимое пробирки охлаждают. В пробирки добавляют по несколько капель раствора Люголя и наблюдают за появлением характерного окрашивания.
3. Кислотный гидролиз полисахаридов
При нагревании раствора крахмала или гликогена с минеральными кислотами происходит гидролиз полисахаридов с образованием -D-глюкозы, присутствие которой можно обнаружить с помощью цветной реакции.
В пробирки помещают по 200 мг порошка выделенных крахмала и гликогена и добавляют по 5 мл 2%-ного раствора серной кислоты. Пробирки закрывают ватными пробками и помещают в кипящую водяную баню на час. По окончании гидролиза пробирки охлаждают, осадки отделяют центрифугированием при 1000 мин1 в течение 15 мин и 23 раза промывают небольшими порциями горячей дистиллированной воды для полного выделения моно- и олигосахаридов. Супернатанты объединяют с промывными водами. Полученные растворы нейтрализуют сухим гидрокарбонатом натрия до рН 7,0 и фильтруют через бумажный фильтр.
4. Качественный и количественный анализ гидролизатов
Убеждаются в отсутствии полисахаридов в гидролизатах путем проведения реакции с раствором Люголя.
Присутствие -D-глюкозы в гидролизатах определяют по реакции Молиша. Углеводы при взаимодействии с концентрированной серной кислотой дегидратируются с образованием фурфурола и 5-оксиметилфурфурола, которые конденсируются с -нафтолом с образованием триарилметанового хромогена. Последний окисляется серной кислотой, и образуется хиноидное соединение красно-фиолетового цвета.
На дно пробирки аккуратно вносят 2 мл концентрированной серной кислоты, сверху которой осторожно наслаивают 1 мл гидролизата и добавляют 0,5 мл 0,2%-ного спиртового раствора -нафтола. Появление на границе раздела фаз красно-фиолетового кольца свидетельствует о присутствии в гидролизате моносахаридов.
Количественное определение содержания -D-глюкозы в гидролизатах проводят по методу Миллера. При взаимодействии моносахаридов с 3,5-динитросалициловой кислотой последняя восстанавливается в 3-амино-5-нитросалициловую кислоту, имеющую желто-оранжевую окраску.
В пробирки вносят 1,5 мл гидролизатов и добавляют 1,5 мл динитросалицилового реактива. Пробирки закрывают ватными пробками и помещают в кипящую водяную баню на 15 минут. Затем пробирки быстро охлаждают до температуры (20 ± 2)С и для стабилизации окраски приливают по 0,5 мл 40%-ного раствора сегнетовой соли.
Измеряют экстинкцию растворов при 582 нм в кюветах (l = 0,5 см) на фотоэлектроколориметре против контрольной пробы (вместо гидролизата берут дистиллированную воду, остальные реактивы добавляют в том же объеме и смесь выдерживают такое же время). Каждое определение проводят 3 раза и за результат измерения принимают среднее арифметическое значение экстинкции.
Концентрацию глюкозы в исследуемом растворе определяют по калибровочному графику зависимости экстинкции от концентрации, предварительно построенному для растворов глюкозы с известной концентрацией.
Для построения калибровочного графика непосредственно перед измерением готовят растворы глюкозы с концентрацией 200, 400, 600, 800 и 1000 мкг/мл. Затем с каждым из растворов проводят цветную реакцию по вышеуказанной методике и измеряют величину экстинкции окрашенных растворов при 582 нм против контрольной пробы. Строят калибровочный график зависимости Е582 от концентрации глюкозы в растворе.
Следует помнить, что при каждой смене реактивов необходимо заново строить калибровочный график.
Динитросалициловый реактив. Взвешивают 1 г 3,5-динитро-салициловой кислоты, 1 г NaOH, 0,05 г Na2SO4, 0,2 г фенола и растворяют в дистиллированной воде при непрерывном перемешивании, доводя объем раствора до 100 мл. Срок годности раствора при хранении в защищенном от света месте и при температуре (20 ± 2)С составляет 1 месяц.