uchebnik

71

4)Собранный материал доставляют в лабораторию и исследуют в максимально сжатые сроки. Если хранение и транспортировка длятся более 24 часов и в тех случаях, когда микроорганизмы не стабильны вне организма, для сохранения их жизнеспособности используют поддерживающие (транспортные) среды.

5)Материал для исследования берут по возможности до начала лечения противомикробными препаратами.

Если взятие, хранение и транспортировка материала выполнены медперсоналом правильно, микроорганизмы в нем сохраняются, а их численность снижается незначительно.

Обнаружение возбудителя в исследуемом материале можно осуществить тремя группами методов.

Классическое бактериологическое (вирусологическое, микологическое) исследование.

Это так называемый “золотой стандарт” микробиологической диагностики.

Алгоритм бактериологического (вирусологического, микологического) исследования складывается из следующих основных этапов:

первичная микроскопия (необязательный); первичный посев для выделения чистой культуры; накопление чистой культуры;

изучение комплекса биологических свойств выделенной культуры и ее идентификация.

Классическое микробиологическое исследование имеет ряд недостатков. Прежде всего это достаточно длительный процесс. Его минимальный срок 3-4 дня, но могут пройти многие дни и даже недели, прежде чем выделенный возбудитель будет точно идентифицирован. Для некоторых патогенных бактерий (холерный вибрион, дифтерийные бактерии) разработаны ускоренные методы выделения и идентификации, но они позволяют получить ответ не ранее 36-48 часов.

И еще одно. Даже при лабораторном заражении выделить возбудителя удается далеко не всегда, что особенно характерно для вирусных инфекций.

В связи с этим в настоящее время все большее развитие получают методы микробиологической диагностики без выделения чистой культуры, так называемые “non-culture methods”, позволяющие обнаруживать возбудитель или какие либо его компоненты непосредственно в клиническом материале.

К ним относятся методы иммуноиндикации и молекулярногенетические методы.

Иммуноиндикация - это метод иммунодиагностики. Его целью является обнаружение в исследуемом материале антигенов возбудителя. Метод реализуется постановкой реакций иммунитета второго (РПГА, иммунофлюоресценции), третьего (ИФА, РИА) поколений.

72

Целью молекулярно-генетических методов является обнаружение в исследуемом материале нуклеотидных последовательностей ДНК возбудителя. Для этого используются метод ДНК-гибридизации и полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Метод ДНК-гибридизации основан на способности денатурированной одноцепочечной ДНК возбудителя достраивать гомологичную цепь в бесклеточной системе. В качестве материала для этой второй нити используют ДНК-зонды. Это лабораторно приготовленные фрагменты молекулы ДНК, гомологичные фрагментам ДНК искомого возбудителя. Зонд метят либо радиоактивным изотопом, либо ферментом. В последнем случае для регистрации включения ДНК-зонда в ДНК бактерий, содержащихся в исследуемом материале, к пробе добавляют субстрат, соответствующий использованному ферменту. Положительная реакция субстрат-фермент проявляется в изменении окраски субстрата и свидетельствует о соответствии ДНК-зонда ДНК возбудителя, находящейся в исследуемом материале.

ПЦР - это метод направленной амплификации (воспроизведения) ДНК, позволяющий найти в исследуемом клиническом материале небольшие участки генетической информации любого организма и многократно размножить его. Для реализации ПЦР создают набор праймеров - фрагментов ДНК, являющихся маркером данного возбудителя. При добавлении такого праймера к пробе исследуемого материала, содержащей денатурированную одноцепочечную ДНК, происходит их соединение с комплементарным участком ДНК. Образовавшийся двунитевой стартовый участок воспроизводится с помощью фермента Taq-полимеразы, входящей в набор для ПЦР. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат матрицей для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации и так далее. Это и есть цепная реакция.

Втечение нескольких часов происходит 30-40 циклов амплификации и синтезируется количество ДНК (нуклеотидных последовательностей), достаточное для визуального учета.

Преимущества молекулярно-генетических методов диагностики состоят

вих высокой специфичности и чувствительности. Они позволяют обнаруживать в исследуемом материале единичные клетки возбудителя.

Взадачи микробиологической диагностики, кроме обнаружения возбудителя, входит и выявление иммунологических изменений в организме больного, соответствующих инфекционному заболеванию. Для этого применяется серологическое исследование или серодиагностика.

Серодиагностика.

Это метод диагностики, целью которого является обнаружение в сыворотке обследуемого антител и нарастания их титра (количества). Для его реализации используют различные реакции иммунитета как простые (агглютинация и ее разновидности), так и сложные (РСК, ИФА и др.).

73

Нарастание титра антител, т.е. их инфекционная природа, устанавливается при исследовании парных сывороток. Так называют сыворотки, взятые от одного больного в разные сроки болезни с интервалом 5-7 дней.

При исследовании сыворотки любого человека в ней можно обнаружить антитела различного происхождения - инфекционные, постинфекционные, нормальные, поствакцинальные. Концентрации трех последних различны, но на протяжении достаточно длительных промежутков времени титр их находится на одном и том же уровне или постепенно снижается.

При инфекционных заболеваниях в связи с размножением возбудителей нарастает антигенное раздражение. В ответ на это в сыворотке возрастает количество инфекционных, связанных с заболеванием, антител. Таким образом, титр инфекционных антител нарастает в динамике заболевания, при этом абсолютно не важно, в каком количестве обнаруживаются специфические антитела при первом исследовании.

Серологический метод диагностики применяют с конца первой, начала второй недели заболевания.

Для осуществления серологических реакций, т.е. взаимодействия антител с антигеном, при серодиагностике для обнаружения искомого антитела к сыворотке прибавляют известный антиген - или микроорганизмы, вызвавшие их образование, или их компоненты, обладающие иммуногенностью.

Вкачестве известного антигена для серодиагностики используются разнообразные антигенные диагностикумы. Они могут быть обычными диагностикумами, представляющими собой взвесь убитых микроорганизмов или их отдельных антигенов, или эритроцитарными диагностикумами - взвесью эритроцитов, на которых адсорбированы микроорганизмы или их антигены.

Вдиагностическом варианте можно использовать почти все указанные для иммуноиндикации реакции иммунитета, но меченными радиоизотопами, флюорохромами должны быть антигены, а не антитела.

Отличие диагностического варианта ИФА будет также заключаться в использовании не антимикробной иммунной меченной ферментом сыворотки,

амеченной ферментом антиглобулиновой сыворотки, воспринимающей человеческие антитела в исследуемой сыворотке как антигены.

Кроме того, для оценки напряженности антитоксического иммунитета при дифтерии и скарлатине раньше использовали реакция токсиннейтрализации in vivo (в организме здорового человека). Отсутствие гиперемии (местного действия токсина) через 24 часа после введения (в/к 1/40 DLM) токсина Шика (дифтерийный) или Дика (скарлатинозный) говорит о нейтрализации их антитоксинами, т.е. антителами против бактерийных и некоторых других токсинов, и в конечном счете о наличии антитоксического иммунитета. В настоящее время эти реакции не применяются, а для оценки напряженности антитоксического иммунитета и отбора контингента для

74

ревакцинации при дифтерии используется РПГА с дифтерийным антигенным анатоксическим диагностикумом.

Аллергическая диагностика

При многих инфекционных заболеваниях развивается состояние повышенной чувствительности к повторному введению возбудителя или продуктов его жизнедеятельности. Такое состояние называется

инфекционной аллергией.

Инфекционная аллергия развивается при туберкулезе, туляремии, бруцеллезе, сапе, сифилисе, сибирской язве, токсоплазмозе, паротите, простом герпесе и ряде других инфекций. Она может длительно (годами) сохраняться и после выздоровления.

Для выявления инфекционной аллергии применяют аллергические диагностические пробы. При их постановке строго внутрикожно вводят соответствующий аллерген.

Наличие гиперемии и инфильтрата указывает на положительный результат реакции, т.е. наличии инфекционной аллергии.

Аллергические диагностические пробы используют для диагностики ткуберкулеза (реакция Манту), бруцеллеза (проба Бюрне), туляремии (проба с тулярином), сибирской язвы (проба с антраксином), мягкого шанкра (реакция Дюкрея), проказы (реакция Мицуды). Последняя позволяет даже дифференцировать туберкулоидную (лепромин-положительную) форму проказы от лепроматозной (лепромин-отрицательной).

Положительная кожная аллергическая проба указывает, что введение аллергена при постановке пробы является повторным, т.е. индивидуум в прошлом имел контакт с микробным агентом. Здесь сказывается основной недостаток диагностической ценности кожно-аллергических проб, т.к. они могут быть положительными не только у инфицированных, но и у привитых против этих болезней, а также у лиц, переболевших много лет назад, в том числе и у носителей, т.е. положительный тест у здоровых лиц указывает только на контакт, осуществленный в прошлом, с микробным антигеном.

Истинное диагностическое значение при определении природы заболевания имеет только переход от отрицательной кожной пробы к положительной, который происходит в течение болезни. Кроме того, вираж реакции, т.е. увеличение выраженности ее проявления при повторном исследовании, также служит основанием для более детального обследования на инфицированность данным возбудителем.

При приеме кортикостероидных гормонов, иммунодепрессантов, саркоидозе, болезни Ходжкина и других опухолях учет результатов постановки аллергических проб затруднен, потому что в этих случаях наблюдается явление называемое анергия, т.е. значительное снижение общей кожной реактивности.

75

Более того, при появлении сыпи у детей, когда ребенок переносит одно из таких заболеваний как корь, ветряная оспа, также может наблюдаться состояние анергии, и при постановке в этот период пробы Манту туберкулиноположительный ребенок может стать временно туберкулиноотрицательным, т.е. получается ложноотрицательный результат.

Наиболее широко используются в скрининг - обследовании широких слоев населения на инфицированность этими возбудителями следующие аллергические диагностические пробы.

Проба Манту с туберкулином при туберкулезе (положительна - 5 ТЕ - ≥10мм).

Проба Бюрне с бруцеллином - появляется к концу 1 месяца и сохраняется годами.

Проба с антраксином при сибирской язве - появляется с первых дней болезни и положительна в течение многих лет после выздоровления.

Проба с тулярином при туляремии - появляется с 3-5 дня после инфицирования и сохраняется годами.

Положительная реакция Дюкрея при мягком шанкре появляется с 8 дня заболевания и может сохраняться годами.

76

Глава 8. Основы общей вирусологии.

Вирусы - это уникальные микроорганизмы, составляющие третье царство живой природы - царство Vira.

Представители этого царства характеризуются следующими признаками. В отличие от всех других организмов они содержат лишь один тип нуклеиновой кислоты (1), не имеют собственных белок-синтезирующих и энергетических систем (2), не имеют клеточной организации (3), обладают уникальным способом репродукции (4). Его уникальность состоит в том, что синтез основных структурных компонентов вирусов (белков и нуклеиновых кислот) происходит в разное время и в разных местах пораженной клетки. Этот способ репродукции называется дисъюнктивным (разобщенным). Наконец паразитизм вирусов - паразитизм особого рода, паразитизм на генетическом уровне (5).

Вирусы существуют в двух формах: внеклеточной (вирион) и внутриклеточной.

Размеры вирионов измеряются в нанометрах, т.е. они в тысячи раз меньше клеток. Малые размеры обуславливают прохождение вирусов через бактериальные фильтры - фильтруемость.

В связи с отсутствием собственных белок-синтезирующих и энергетических систем вирусы не растут на искусственных питательных средах. Да и само понятие рост, как увеличение биомассы, к ним не применимо.

Существование вирусов тесно связано с клеткой хозяина. Однако это совершенно иной внутриклеточный паразитизм нежели паразитизм гонококков, риккетсий, хламидий, малярийного плазмодия. Вирусы репрессируют (подавляют функцию) клеточного генома, а ее метаболические системы используют для синтеза собственных структурных компонентов. Более того, их генетический аппарат полностью или частично может встраиваться в клеточный геном и в дальнейшем функционировать и воспроизводиться как его часть. Это и есть проявления паразитизма на генетическом уровне.

Близки к вирусам вироиды, инфекционные молекулы кольцевой РНК, и прионы - инфекционные белки, продукты и индукторы неизвестных генов. Они способны поражать нервные клетки, вызывая губчатые энцефалопатии. Вироиды весьма близки плазмидам - внехромосомным генетическим элементам бактерий.

8.1. Строение вирионов.

77

Внеклеточная форма существования вирусов называется вирионом. Вирионы имеют различную форму (круглая, нитевидная, палочковидная, многогранника) и величину. Самые мелкие близки к размерам крупных белковых молекул, самые крупные - мельчайшим бактериям.

Вирионы имеют единую схему организации.

В центре вириона располагается нуклеиновая кислота вируса. По своему составу вирусные нуклеиновые кислоты не отличаются от нуклеиновых кислот прокариотов и эукариотов, а вот их строение может быть различным. Это могут быть одноили двунитевые, линейные или кольцевые, цельные или фрагментированные молекулы. Тип нуклеиновой кислоты - важнейший таксономический признак вирионов.

Вирусная нуклеиновая кислота покрыта белковой оболочкой, которую называют капсидной. Капсидная оболочка состоит из отдельных субъединиц - капсомеров. Их количество может быть различным. Белки капсидной оболочки обычно простые и способны к самосборке. Пространственная организация белков капсидной оболочки, их взаиморасположение определяет тип симметрии нуклеокапсида - спиральный, кубический или смешанный. Тип симметрии нуклеокапсида - важный таксономический критерий.

Простейшие вирусы представляют собой нуклеокапсид.

Вирионы многих вирусов поверх капсидной покрыты суперкапсидной оболочкой. Это сложноорганизованная структура, включающая белковый, углеводный и липидный компоненты. Наличие липидов делает вирусы, имеющие суперкапсидную оболочку, чувствительными к эфиру. Белки суперкапсидной оболочки - это сложные белки. В состав суперкапсидной оболочки могут входить элементы клетки хозяина.

Наличие суперкапсидной оболочки - одно из важнейших таксономических признаков вирусов.

8.2. Функциональное значение структурных компонентов вириона.

Функция вирусных нуклеиновых кислот независимо от их типа состоит в хранении и передаче генетической информации.

Вирусные ДНК могут быть линейными (как у эукариотов) или кольцевыми (как у прокариотов). Однако в отличие от ДНК тех и других она может быть представлена однонитевой молекулой. Вирусные РНК имеют разную организацию (линейные, кольцевые, фрагментированные, одно- и двунитевые). Они могут быть представлены плюс или минус нитями.

Плюс-нити функционально тождественны и-РНК, т.е. способны транслировать закодированную в них генетическую информацию на рибосомы клетки хозяина.

78

Минус-нити не могут функционировать как и-РНК, и для трансляции содержащейся в них генетической информации необходим синтез комплементарной плюс-нити.

РНК плюс-нитевых вирусов в отличие от минус-нитевых имеют специфические образования, необходимые для узнавания рибосом.

У двунитевых как ДНК-, так и РНК-содержащих вирусов информация обычно записана только в одной цепи, чем достигается экономия генетического материала.

Вирусные белки.

По локализации в вирионе они делятся на капсидные, белки суперкапсидной оболочки и геномные.

Белки капсидной оболочки у нуклеокапсидных вирусов выполняют защитную и рецепторную функции, т.е. защищают вирусную нуклеиновую кислоту и участвуют в адсорбции вирусов на клетках хозяина и проникновении в них.

Белки суперкапсидной оболочки как и белки капсидной оболочки выполняют защитную и рецепторную функции. Это сложные белки - липо- и гликопротеиды.

Некоторые из этих белков могут формировать морфологические субъединицы в виде шиповидных отростков и обладают свойствами гемагглютинина (вызывают агглютинацию эритроцитов) или нейраминидазы (разрушают нейраминовую кислоту, входящую в состав клеточных стенок).

Отдельную группу составляют геномные белки. Они ковалентно связаны с геномом и образуют с вирусной нуклеиновой кислотой рибоили дезоксирибонуклеопротеиды. Основная функция геномных белков - участие в репликации вирусной нуклеиновой кислоты и реализации содержащейся в ней генетической информации. Это РНК зависимая РНК-полимераза, обратная транскриптаза. В отличии от белков капсидной и суперкапсидной оболочки, это не структурные, а функциональные белки.

Все вирусные белки выполняют и функцию антигена, т.к. являются продуктом вирусного генома, т.е. чужеродны для организма.

8.3. Систематика вирусов.

Представители царства Vira по типу нуклеиновой кислоты делится на 2 подцарства - рибовирусы и дезоксирибовирусы. В подцарствах выделяют семейства, рода и виды.

Принадлежность вирусов к тому или иному семейству (всего их 19) определяется строением и структурой нуклеиновой кислоты, типом симметрии нуклеокапсида, наличием суперкапсидной оболочки.

79

Принадлежность к тому или иному роду и виду связано с другими биологическими свойствами вирусов: размер вирионов, способность размножаться в культурах ткани и курином эмбрионе, характер изменений, происходящих в клетках под воздействием вирусов, антигенные свойства, пути передачи, круг восприимчивых хозяев.

Вирусы - возбудители болезней человека относятся к 6 семействам ДНК-овых и 13 семействам РНК-овых вирусов. Краткая характеристика этих семейств приведена в таблицах 2, 3.

80

Таблица 2

Некоторые характеристики РНК-овых вирусов патогенных для человека.

**- раньше входили в состав семейства Пикорнавирусов, отличаются расположением капсомеров в капсидной оболочке в виде чаш

***- приведены размеры диаметра нитевидных вирионов, в длину достигают 1200-4000 нм