Хромосомный и геномный уровни организации наследственного материала клетки

Цель занятия: Знать

• Особенности генетического материала прокариотической клетки.

• Особенности генетического материала эукариотической клетки.

• Строение хромосомы эукариот на разных этапах жизненного цикла клетки.

Ознакомиться со строением политенных хромосом, хромосом типа «ламповых щеток».

Внеаудиторная работа

Задание 1. Генетический материал прокариотической клетки

Наследственный материал прокариотической клетки представлен нуклеоидом - образованием, состоящим из ДНК, белков и РНК. Оболочки вокруг нуклеоида нет. Ознакомьтесь по табл. 1 с особенностями организации и функциями компонентов генетического материала прокариотической клетки на примере бактериальной.

Задание 2. Генетический материал эукариотической клетки

Генетический материал эукариотической клетки представ­лен ДНК хромосом ядра, ДНК митохондрий, а в растительной клетке - ДНК хлоропластов.

Ядерный наследственный материал человека содержит 46 хромосом, в каждой хромосоме 1 молекула ДНК (2n2с). Хро­мосомы контактируют с оболочкой ядра теломерными района­ми.

Митохондриальный наследственный материал (обеспечи­вает цитоплазматическую материнскую наследственность) представлен двухнитчатой кольцевой молекулой ДНК, свобод­ной от белков. Она содержит 16596 пар нуклеотидов. Ее струк­турные гены контролируют синтез двух различных молекул рРНК, 22 вариантов тРНК и 13 различных белков, включая не­которые из ферментов окислительного фосфорилирования. Бо­лее 95% митохондриальных белков кодируется генами ядерной ДНК.

ДНК хлоропласта - двухнитчатая, кольцевая, свободная от белков. Содержание G - С-пар нуклеотидов в ДНК хлоро­пласта значительно отличается от найденного в ядерной и митохондриальной ДНК. Все гены в геноме хлоропласта транс­лируются на собственных рибосомах этой органеллы.

Ответьте на вопросы:

• Какой набор хромосом - гаплоидный или диплоидный - в ядре, митохондриях, хлоропластах эукариотической клетки?

• Какой тип наследственности определяет генетическая система ядра? Митохондрий? Хлоропластов?

• По материнской или отцовской линии передается мито­хондриальный генетический материал?

Задание 3. Организация хромосомы эукариот.

Хромосома эукариот имеет разную морфологию на протя­жении жизненного цикла клетки из-за различной степени компактизации в хромосоме ДНП - ДНК-гистонового комплекса (ДНК + основные белки-гистоны или кислые белки).

Первый уровень компактизации хроматина - нуклеосомный. Нуклеосома представляет собой глобулу, состоящую из 8 молекул гистонов, на которую накручена ДНК (примерно из 200 нуклеотидных последовательностей), делая 1,5 оборота.

На втором уровне компактизации ДНП - фибриллярном -нуклеосомная нить укладывается в нитчатые структуры.

Третий и четвертый уровни компактизации ДНП соответ­ствуют интерфазной и метафазной хромосомам.

Ознакомьтесь по табл. 2 с уровнями многоступенчатой укладки ДНП в хромосоме эукариот.

В интерфазе хромосомы деконденсированы и выявляются в виде глыбок хроматина. В метафазе митоза хромосомы мак­симально конденсированы, каждая хромосома состоит из двух хроматид, соединенных центромерой в области первичной пе­ретяжки. В зависимости от положения центромеры хромосомы подразделяются на мета-, субмета- и акроцентрические.

В некоторых хромосомах есть вторичная перетяжка, свя­занная с ядрышковым организатором. Она отделяет участок хромосомы - спутник. Вторичная перетяжка в других хромосо­мах может быть и не связана с ядрышком.

Концевые участки хромосом - теломеры - у большинства видов сходны. В их состав входят сотни повторенных последо­вательностей нуклеотидов ДНК - TTAGGG.

Теломеры связаны с внутренней мембраной ядерной обо­лочки, представлены гетерохроматином, играют защитную роль и периодически наращиваются специальными фермента­ми за счет самовосстановления теломерной ДНК.

Таблица 2

• В виде чего окрашенные хромосомы выявляются в интерфазной клетке?

Аудиторная работа

Задание 4. Нуклеосомный уровень компактизации хроматина

Напишите последовательность уровней компактизации ДНП у эукариот в жизненном цикле клетки, начиная с нуклеосомного уровня.

Рассмотрите на слайде и зарисуйте схему строения нуклеосомы. Обозначьте белковый кор, накрученную на него ДНК, линкерную ДНК.

Рассчитайте число нуклеосом, необходимых для упаковки ДНК гена, кодирующего белок из 400 аминокислот. Величина фрагмента ДНК одной нуклеосомы равна примерно 200 парам нуклеотидов.

Ответьте на вопросы:

• Какие белки обеспечивают нуклеосомный уровень ор­ганизации хроматина? Какие функции они выполняют?

• Какова степень укорочения хроматина на уровне нуклеосомной нити, элементарной фибриллы, интерфазной и метафазной хромосом?

Задание 5. Метафазные хромосомы эукариот

Метафазные хромосомы можно рассмотреть на постоян­ном препарате «Клетки корешка лука» или на приготовленном самостоятельно временном препарате этого объекта.

Для изготовления препарата поместите отрезанный коре­шок лука в краситель на 30 минут, затем промойте в течение 2 минут в пузырьке с 45%-ным раствором уксусной кислоты.

Компактизация ДНП в хромосоме эукариот на протяжении жизненного цикла клетки

Уровни компактизации ДНП	Строение	Степень укорочения
Первый	Нуклеосомная нить. ДНК + белки-гистоны Н2А, Н2В, НЗ, Н4.	в 6-7 раз
Второй	Хроматиновая фибрилла. Нуклеосом­ная нить + белок-гистон HI.	в 42 раза
Третий	Интерфазная хромосома (хроматин). Хроматиновая фибрилла с помощью негистоновых белков укладывается в петли.	в 1600 раз
Четвертый	Метафазная хромосома. Суперконден­сация хроматина.	В 8000 раз

В зависимости от компактизации хроматина в интерфазный период в хромосоме различают эухроматин и гетерохроматин. Эухроматин в интерфазе деконденсирован, слабо окрашивается, генетически активен, реплицируется в начале S-периода, содер­жит уникальные и умеренные повторы нуклеотидов. Гетерохро­матин всегда конденсирован, интенсивно окрашивается, генети­чески неактивен, реплицируется в конце S-периода, содержит часто повторяющиеся последовательности нуклеотидов. Гетеро­хроматин чаще всего располагается в прицентромерных, иногда - в прителомерных областях, но вкрапления гетерохроматина есть и в эухроматиновых участках.

Ответьте на вопросы:

• Имеют ли хромосомы постоянную структуру на разных стадиях жизненного цикла клетки?

-36-

Корешок, придерживая его препаровальной иглой, расщепите на поперечные полоски толщиной примерно 1мм. Полоски (1-2) по­местите на предметное стекло в каплю 45%-ного раствора саха­розы, накройте покровным стеклом и через слой фильтрованной бумаги слегка надавите большим пальцем.

Под малым увеличением микроскопа найдите делящиеся клетки, переведите на большое увеличение и изучите клетки, на­ходящиеся на стадии метафазы. Зарисуйте несколько метафазных хромосом.

Задание 6. Политенные (или гигантские) хромосомы

Политенные хромосомы характерны для клеток слюнных желез личинок ряда видов двукрылых насекомых (дрозофил, хирономид). Они представляют собой лентовидные многонит­чатые (до 500 нитей) образования. Формируются гигантские хромосомы в результате эндомитоза - многократной реплика­ции ДНК в одной и той же клетке и последующем нерасхо­ждении хромосомных нитей. По длине неоднородны - состоят из чередующихся дисков и междисков, создавая поперечную видоспецифичную исчерченность. Диски - более конденсиро­ванные участки, междиски - менее конденсированные. В таких хромосомах встречаются пуфы - локусы с рыхло упакованны­ми фибриллами хроматина. Здесь идет активный синтез РНК.

Изучите под малым увеличением микроскопа постоянный препарат политенных хромосом. Зарисуйте участок политенной хромосомы, обозначив диски, междиски, пуфы, ядрышко.

Ответьте на вопросы:

• К интерфазным или метафазным хромосомам относятся политенные хромосомы двукрылых насекомых?

• Какое значение имеют политенные хромосомы двукры­лых насекомых в цитогенетических исследованиях?

Задание 7. Хромосомы типа «ламповых щеток»

Хромосомы типа «ламповых щеток» обнаружены в ядрах ооцитов и сперматоцитов животных и растений. У человека встречаются в ооцитах I порядка на стадии диплотены профа­зы I мейоза. Состоят из двух гомологов, каждый из которых окружен петлями из нитчатых структур; имеется ось и хромо­меры. Петли парносимметричные, они отходят от оси и пред­ставляют собой деконденсированные участки активного хро­матина. Ось представлена спаренными сестринскими хроматидами. Хромомеры - участки конденсированного хроматина -соответствуют дискам политенной хромосомы. В раскручен­ном состоянии представляют собой петлю хромосом типа «ламповых щеток».

Рассмотрите на фотографиях строение хромосом типа «ламповых щеток». Найдите ось хромосомы, хромомеры.

Задание 8. Проверка усвоения материала

Проверьте усвоение материала по тестам из методического пособия «Основы цитологии» (с. 12, 13, 65-69).

Кариотип и идиограмма человека

Цель занятия: Знать

• Характеристику карнотита человека;

• Денверскую и Парижскую классификации хромосом че­ловека.

Уметь

• Идентифицировать хромосомы человека до групп.

• Использовать знания о кариотипе человека для выяв­ления геномных мутаций. -39-

Ознакомиться

• С методикой приготовления препаратов хромосом чело­века.

• С современными методами индентификации хромосом человека.

• С полиморфизмом кариотипа человека.

• С показаниями для проведения цитогенетического ана­лиза человека.

Внеуадиторная работа Задание 1. Кариотип

Каждый вид имеет характерный и постоянный для него хромосомный набор - кариотип. В характеристику кариотипа входят диплоидное (2n) число хромосом, размеры и форма их, наличие перетяжек и спутников, соотношение длин плеч, чередование эу- и гетерохроматина.

Ознакомьтесь с хромосомными числами (2n) ряда видов животных и растений (табл. 1).

Ответьте на вопросы:

• Зависит ли число хромосом в кариотипе от уровня орга­низации вида?

• В чем суть правила парности хромосом в диплоидном наборе?

• Какие хромосомы в кариотипе называют аутосомами, половыми хромосомами?

• Отличаются ли кариотипы мужских и женских организмов?

• Напишите хромосомные формулы мужчины и жен­щины.

• В чем суть правила индивидуальности хромосом?

Таблща 1

Хромосомные числа ряда видов животных и

растений

Виды	2п	Виды	2п
Человек	46	Сазан	104
Горилла	48	Речной рак	116
Шимпанзе	48	Таракан	48
Собака	78	Аскарида	2
Кошка	36	Малярийный плазмодий	2
Свинья	38
Осел	62	Радиолярия	1600
Крыса	42	Пшеница	42
Мышь	40	Лук	16
Курица	78	Картофель	48

Задание 2. Строение метафазной хромосомы

Пользуясь материалом занятия «Воспроизведение на кле­точном уровне. Жизненный цикл клетки» ответьте на вопросы:

• На какой стадии митотического цикла происходит уд­воение хромосом? Как называются образующиеся в этот период две, морфологически идентичные, нити?

• На какой стадии митоза морфологическое строение хромосом становится хорошо выраженным?

• Какие выделяют типы метафазных хромосом в зависи­мости от локализации центромерного района в хромо­соме?

• Какие хромосомы называются спутничными?

• Всегда ли в районе вторичной перетяжки хромосом ло­кализуется ядрышко?

• Отличаются ли по морфологии половые х- и у- хро­мосомы друг от друга?

• С какими аутосомами сходны по морфологии Х-хромосома и Y-хромосома?

Строение и роль разных участков метафазных хромосом

Изучите по табл. 2 особенности строения разных участков метафазной хромосомы. Зарисуйте схему строения метафазной хромосомы и обозначьте короткое и длинное плечи хромосо­мы, хроматиды, первичную и вторичную перетяжку, спутник, теломеры.

Задание 3. Методика приготовления метафазных хромосом человека

Ознакомьтесь с основными этапами приготовления пре­паратов метафазных хромосом человека.

Объектом для приготовления препаратов могут служить делящиеся клетки костного мозга, ткани семенника, хорион, фибробласты кожи, клетки амниотической жидкости.

Наиболее удобным объектом является культура лим­фоцитов периферической крови - берут 1-2 мл венозной крови и добавляют её в смесь питательной среды с фитогемагглютинином (стимулятором митоза). Культивирование лимфоци­тов составляет 48-72 часа.

Для остановки процесса деления клеток на стадии метафазы используют колхицин. Для получения четких метафаз­ных пластинок клетки помещают в гипотонический раствор хлорида кальция или цитрата натрия, где они набухают, разрываются, хромосомы разобщаются и свободно распо­лагаются в цитоплазме.

В результате образуется клеточная суспензия, которую фиксируют смесью метанола и уксусной кислоты (3:1), нано­сят на предметное стекло, высушивают и окрашивают краси­телем.

Анализируют препараты под большим увеличением мик­роскопа с использованием иммерсионного объектива, отыски­вая такие метафазные пластинки, в которых хромосомы рас­полагаются в одной плоскости, и фотографируют их.

Задание 4. Основные методы окрашивания хромосом

Ознакомьтесь по табл. 3 с основными методами окра­шивания хромосом человека.

Определить число, структуру и групповую принад­лежность хромосом (Денверская классификация) позволяет простой метод равномерной окраски хромосом - рутинный

-43-

(стационарная таблица в учебной комнате). Но индивиду­ализировать хромосомы (Парижская классификация) можно только с помощью методов дифференциальной окраски, кото­рые основаны на неоднородности (гетерогенности) хромосом по длине, что проявляется в наличии темных поперечных по­лос - мест связывания с определенным красителем (рис.1).

Поперечным темным полосам (бэндам), выявляемым с по­мощью дифференциальной окраски, присвоены определенные номера, относительно них картируют гены.

Гетерогенность хромосом по длине обусловлена раз­личным чередованием эу- и гетерохроматина в хромосоме; асинхронностью репликации и конденсации отдельных рай­онов хромосомы, например, хромосомы группы А содержат больше эухроматина и поэтому быстрее реплицируются и позднее конденсируются, Y-хромосома более гетерохроматизирована и поэтому реплицируется позднее, а конденси­руется быстрее; различным нуклеотидным составом хромосом.

Задание 5. Показания для цитогенетического анализа хромосом

Показаниями к исследованию хромосом человека служат:

1. Подозрение на хромосомную болезнь.

2. Наличие у ребенка множественных врожденных пороков развития.

3. Многократные (более двух) спонтанные выкидыши, мертворождения.

4. Нарушение репродуктивной функции у женщин или мужчин.

5. Существенная задержка умственного и физического раз­вития у ребенка.

6. Лейкозы.

7. Оценка мутационных воздействий.

-44-

Аудиторная работа

Рис.1. Хромосомы человека (группы, схема сегментации, центромерный индекс (Парижская классификация)

Задание 6. Изучение метафазных хромосом человека на препаратах

Рассмотрите под иммерсионным объективом микроскопа препарат метафазных хромосом человека (рутинная окраска)

Найдите метафазную пластинку с хорошим разбросом всех хромосом.

Подсчитайте количество хромосом. Различаются ли они по размеру и форме?

Найдите метацентрические, субметацентрические, акро-центрические хромосомы.

Можно ли при такой окраске выделить половые хромо­сомы?

Задание 7. Идиограмма человека

Графический рисунок кариотипа называется идиограммой (рис. 2). На идиограмме хромосомы гаплоидного набора рас­положены в порядке уменьшения их длины. Хромосомы объе­динены в группы в зависимости от длины, положения центро­меры, наличия вторичных перетяжек и спутников.

Пользуясь стационарным стендом в учебной аудитории «Кариотип человека» заполните табл. 4 «Характеристика метафазных хромосом человека».

Ответьте на вопросы:

• Какие хромосомы в кариотипе человека являются мета-, субмета- и акроцентрическими?

• Какие хромосомы имеют вторичную перетяжку, связан­ную с ядрышковым организатором и не связанную с ним?

• Какие хромосомы являются спутничными?

Рис. 2. Идиограмма хромосомного набора мужчины.

-48-

-49-

Задание 8. Центромерный индекс

Центромерный индекс (I^c) - это отношение длины корот­кого плеча ко всей длине хромосомы, выраженное в процентах или долях единицы. Центромерный индекс метацентрических хромосом от 45 до 50% (0,45 - 0,5), субметацентрических хро­мосом - от более 25 до 45% (0,25 - 0,45), акроцентрических -меньше или равен 25% (0,25).

Вычислите центромерные индексы Х- и Y-хромосом, если известно, что длина Х-хромосомы в среднем 6,8 мкм, длина короткого плеча - 2,6 мкм; длина Y-хромосомы - 2,8 мкм, дли­на короткого плеча - 0,5 мкм.

К какому типу хромосом относятся Х- и Y-хромосомы с учетом их центромерного индекса?

Задание 9. Кариотипический анализ (УИРС)

Основная задача кариотипического анализа состоит в уста­новлении качественных и количественных отклонений хромосом от нормы.

Ознакомьтесь с методическими указаниями кариотипи­ческого анализа человека и проанализируйте по рис. 3 или 4 предложенные фотографии метафазных пластинок (рутинная окраска).

Методические указания к кариотипическому анализу метафазных хромосом человека

1. На метафазной пластинке найдите крупные хромосомы группы А, подсчитайте из количество и обозначьте каж­дую хромосому буквой А.

2. Найдите крупные субметацентричные хромосомы группы В, подсчитайте их количество, обозначьте каждую хромо­сому буквой В.

3. Найдите средние акроцентрические хромосомы группы D, подсчитайте их число, обозначьте каждую хромосому буквой D.

4. Найдите мелкие акроцентричные хромосомы группы G, подсчитайте их число, обозначьте каждую хромосому буквой G. Обратите внимание, что Y-хромосома по своим параметрам является мелким акроцентриком и поэтому идентифицируется вместе с хромосомами группы G.

5. Найдите мелкие метацентрические хромосомы группы F, подсчитайте их число, обозначьте каждую хромосому буквой F.

6. Найдите мелкие метацентрические хромосомы группы Е, подсчитайте их число, обозначьте каждую хромосому буквой Е.

7. Оставшиеся средние субметацентрические хромосомы обозначьте буквой С, подсчитайте их число, учитывая, что Х-хромосома по своим параметрам является субметацентриком и поэтому идентифицируется вместе с хромосомами группы С.

Ответьте на вопросы:

• Мужчине или женщине принадлежит исследуемый ка­риотип?

• Имеются ли (и какие) количественные нарушения в анализируемом хромосомном наборе?

• Напишите хромосомную формулу проанализированного кариотипа человека.

• Позволяет ли рутинный метод окраски индивиду­ализировать все хромосомы внутри каждой группы?

• Вычислите центромерный индекс для всех хромосом группы А. Для этого измерьте длину каждой хромосомы и длину её короткого плеча. По центромерному индексу определите тип каждой хромосомы группы А.

Задание 10. Половой хроматин (Х- и Y-хроматин)

Х-хроматин (тельце Барра) - это инактивированная и кон­денсированная одна из двух Х-хромосом соматических интер­фазных клеток женщины. В клетках женского эмбриона она инактивируется примерно на 16-20 день развития. Y-хроматин представляет собой блок гетерохроматина в длинном плече Y-хромосомы и выявляется в интерфазных ядрах соматических клеток мужчин.

Препараты полового хроматина можно приготовить, ис­пользуя клетки слизистой ротовой полости, лейкоцитов, фибробластов кожи и клетки волосяной луковицы, окрашивая их ацетоорсеином или флуоресцентными красителями.

Рассмотрите фотографии препаратов Х- и Y-хроматина. Х-хроматин выявляется с внутренней стороны ядра в виде плотной, хорошо окрашенной глыбки, имеющей форму треу­гольника или овала. Клетки мужчины, как правило, без этой глыбки. Зарисуйте несколько клеток эпителия женщины и мужчины и обозначьте Х-хроматин,Y-хроматин.

Ответьте на вопросы:

• Каков биологический смысл явления гетерохроматизации одной из двух Х-хромосом женского организма у человека и млекопитающих?

• Сколько Х- и Y-хроматина выявляется в клетках при сле­дующих кариотипах:

а) 45,Х0 (синдром Тернера-Шерешевского); 6)47,XXY; 48,XXYY; 48,XXXY (разные варианты синдрома Клайнфельтера);

в) 47,ХХХ (синдром трипло-Х);

г) 48,ХХХХ (синдром тетра-Х)?

Задание 11. Полиморфизм хромосом человека

Постоянство числа и формы хромосом у каждого биоло­гического вида является одной из важнейших его характе­ристик. Однако, внутри вида между индивидуумами могут быть различия (полиморфизм) по отдельным хромосомам. Для полиморфизма хромосом человека характерно:

• присутствие варианта полиморфной хромосомы во всех клетках;

• передача варианта хромосомы как простого менделирующего признака от родителей к детям;

• отсутствие заметного фенотипического эффекта (этот критерий не абсолютен).

Истинный полиморфизм хромосом обусловлен вариабель­ностью в размерах их гетерохроматиновых районов и является широко распространенным явлением, обеспечивая уникаль­ность кариотипа каждого человека. У разных людей обнаружи­ваются увеличенные районы вторичных перетяжек длинных плеч аутосом 1, 9, 16 в их околоцентромерной части; вариации размеров коротких плеч всех акроцентрических хромосом; увеличенный спутник в акроцентрических хромосомах; раз­личные размеры спутничной нити в ядрышкообразующих хро­мосомах и др.

Одной из самых вариабельных является Y-хромосома, т.к. примерно половина её длины представлена гетерохроматином. Длина гетерохроматинового блока варьирует от 0,8 до 1,6 мкм. Однако, как увеличение, так и уменьшение количества гетерохроматина не приводит к заметным дефектам фенотипа, жизнедеятельности и плодовитости. У человека даже наличие второй Y-хромосомы (47,XYY) не нарушает репродуктивную функцию.

Ответьте на вопросы:

• Что такое эухроматин и гетерохроматин? Какие виды гетерохроматина существуют? Укажите особенности функционального состояния различных видов гетеро­хроматина.

• Каким гетерохроматином - структурным или факу­льтативным - представлены околоцентромерные блоки хромосом?

• Какие методы окраски необходимо применить для идентификации гетерохроматиновых районов хромо­сом?

• Эухроматина или гетерохроматина в большей степени содержит Y-хромосома? Каким гетерохроматином - структурным или факультативным - представлена дистальная часть Y-хромосомы? Каким методом окраски можно выявить этот участок Y-хромосомы?

• Гетерохроматиновые или эухроматиновые районы под­вержены хромосомному полиморфизму? Приводит ли полиморфизм хромосом к аномалиям фенотипа у чело­века?