Лекция_4_ГИ_М_2014
.pdf
На основе знаний природы и свойств самих белков шелка паутины, а также используя, подсказанный самой природой, процесс переноса практически любой генетической информации в геном растений, нами показана принципиальная возможность биотехнологического получения рекомбинантных аналогов белков паутины в растениях.
Полученные результаты являются фундаментальной основой для разработки высокоэффективной технологии создания биоматериалов с уникальными свойствами.
Использование растений как биофабрик для наработки:
-фармацевтических белков
-антител
-вакцин
-новых биоматериалов
Преимущества и недостатки растений по сравнению с другими системами экспрессии.
vне содержат патогенных для человека вирусов и прионов vнет необходимости в дорогостоящем оборудовании для
культивирования
v разработанные системы агротехники vгликозилирование и фолдинг белков vСпособы доставки – «съедобные вакцины» vнизкий уровень экспрессии
Авидин – 1 бушель (25 кг) кукурузы = 1 т белков куриных яиц
авидин из кукурузы = 0,5% от стоимости авидина из куриных яиц
α-интерферон человека – в хлоропластах табака = 20% ОРБ = 3 мг/г сырой массы
Виды растений, используемые для наработки фармацевтических препаратов:
зерновые |
Авидин (иммунорадиотерапия рака), желудочные липазы |
|
|
табак |
Противораковые белки, гормоны роста человека |
|
|
картофель |
Белки, содержащие антитела scFv, вакцины против вирусов |
|
|
кукуруза |
Моноклональные антитела человека |
|
|
люцерна |
Гемоглобин заменяющие продукты |
|
|
томаты |
Вакцина против гепатита В |
|
|
бананы |
Вакцина против гепатита В |
|
|
|
|
рис |
Бета-каротины для получения витамина А |
|
|
Подходы для производства биоматериалов и фармацевтических препаратов в растениях:
-экспрессия гетерологичных генов в трансгенных растениях (гетерологичный ген вводится в геном растения)
-транзиентная (временная) экспрессия гетерологичных генов в трансгенных растениях:
-биолистический метод
-агроинфильтрация
-инфекция модифицированным вирусными векторами
Трансгенные растения моркови – продуценты антигенов Mycobacterium tuberculosis
Жизненный цикл Mycobacterium tuberculosis
и различные способы вакцинации
Kaufmann S. The Lancet Infectious Diseases Volume 11, Issue 8, 2011, 633 - 640
Концепция «съедобной вакцины»
•чужеродные белки способны синтезироваться в клетках трансгенных растений в их природной, иммунологически активной форме
•антигены (природный и синтезируемый трансгенными растениями) вызывают однотипные иммунологические реакции
•при пероральной доставке антигены способны проходить через желудочно-кишечный тракт теплокровных
•адаптивный мукозный иммунитет
•стабильность целевого иммуногена при хранении
•стандартизация иммуногена
Схема сборки целевого гена и Т-области бинарной плазмиды
cfp10 (303 bp)
|
|
|
dIFN (469 bp) |
up1 |
lo1 |
esat6 (288 bp) |
up3 |
XbaI |
|
|
BamHI |
|
|
|
|
|
up2 |
lo2 |
|
|
link |
|
link |
|
cfp10-esat6- dIFN (1070 bp) |
||
|
|
XbaI |
BamHI |
|
|
|
cfp10-esat6- dIFN |
RB |
npt II tNOS |
CaMV35S |
LB |
pNOS |
cfp10 esat6 dIFN uidA tNOS |
||
Разработка технологии получения трансгенных растений, экспрессирующих антигены возбудителя туберкулеза и иммуномодулирующие медиаторы
Misc Feature 10 Rep Origin 2 |
Misc Feature 1 |
Misc Feature 9 |
Rep Origin 1 |
Misc Feature 8 |
Misc Feature 2 |
Misc Feature 7 |
Misc Feature 3 |
|
Promoter P 1 |
|
nptII |
Misc Feature 6 |
pBI-himera |
|
|
|
|
15796 bp |
|
|
|
|
|
|
|
Terminator 1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Misc Feature 5 |
|
|
Promoter P 2 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
himera |
XbaI (5816) |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Misc Feature 4 |
|
|
cfp-10 |
|
|
Terminator 2 |
gusA |
|
esat-6 |
|
|
|
gamma-IFN |
|
|
||
|
|
|
|
||
|
BamHI (6860) |
|
|
|
|
Карта плазмиды pBI-himera. Гибридный ген |
|
1. ESAT6; |
|||
himera встроен по XbaI и BamHI сайтам за |
|
||||
промотором вируса мозаики цветной капусты |
Схема сборки гибридных генов |
2. CFP10; |
|||
CaMV 35S (promoter P2). |
|
|
3. ESAT6+ CFP10+γ-IFN |
||
|
|
|
|
|
|
Электрофорез ПЦР-продуктов, амплифицированных с
праймерами, специфичными к гену esat6, в 1,5% агарозном геле 1 – ДНК нетрансгенного растения моркови,
2 - 6 – ДНК растений моркови, трансформированных плазмидой pbi121, несущей в своем составе ген esat6,
7 - ДНК плазмиды pbi121, несущей конструкцию с геном esat6.
8 – ДНК маркер рBluescript II SK(+),
гидролизованная эндонуклеазой рестрикции MspI («Сибэнзим», г. Новосибирск, Россия).
9 - отрицательныйконтроль (без матрицы ДНК)